pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind utilizarea metodei de identificare microscopica şi estimare a constituentilor de origine animala în controlul oficial al furajelor
Ministrul agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor,având în vedere prevederile art. 31 alin. 1 din Legea sanitară veterinara nr. 60/1974, republicată, cu modificările şi completările ulterioare,în temeiul Hotărârii Guvernului nr. 12/2001 privind organizarea şi funcţionarea Ministerului Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor, cu modificările şi completările ulterioare,vazand Referatul de aprobare nr. 146.034 din 26 noiembrie 2001, întocmit de Agenţia Naţionala Sanitară Veterinara,emite următorul ordin: +
Articolul 1Se aprobă Norma sanitară veterinara privind utilizarea metodei de identificare microscopica şi estimare a constituentilor de origine animala în controlul oficial al furajelor, prevăzută în anexa care face parte integrantă din prezentul ordin. +
Articolul 2Agenţia Naţionala Sanitară Veterinara, Institutul de igiena şi sănătate publică veterinara şi direcţiile sanitare veterinare judeţene şi a municipiului Bucureşti vor aduce la îndeplinire prevederile prezentului ordin. +
Articolul 3Agenţia Naţionala Sanitară Veterinara va controla modul de aducere la îndeplinire a prevederilor prezentului ordin. +
Articolul 4Prezentul ordin va fi publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, şi va intra în vigoare în termen de 10 zile de la data publicării acestuia.Ministrul agriculturii,alimentaţiei şi pădurilor,Ilie Sarbu +
Anexa 1NORMA SANITARĂ VETERINARAprivind utilizarea metodei de identificare microscopica şi estimare a constituentilor de origine animala în controlul oficial al furajelor +
Capitolul 1Prevederi generale1. Toate probele de furaje supuse controlului oficial şi pentru care exista interdicţia de a conţine constituenti de origine animala vor fi controlate obligatoriu şi prin examen miscroscopic.2. Fixarea liniilor directoare prevăzute în cap. II, precum şi respectarea procedurilor de examinare microscopica nu exclud folosirea şi a altor metode de analiza, care vor fi validate ştiinţific şi aprobate de autoritatea sanitară veterinara competenţa, pentru identificarea şi/sau estimarea constituentilor de origine animala.3. În cazul depistarii de probe cu rezultate pozitive în urma utilizării metodei microscopice, probele respective vor fi analizate obligatoriu şi prin alte metode mai performanţe (inclusiv identificarea speciei), în vederea clarificarii situaţiei.4. Furajele în care au fost depistati constituenti de origine animala vor putea fi folosite în hrana altor specii la care nu exista interdicţie pentru astfel de componente.5. Institutul de igiena şi sănătate publică veterinara va lua măsuri de instruire a personalului propriu, a celui din laboratoarele sanitare veterinare de stat judeţene, în vederea implementarii acestor prevederi.6. Orice rezultat pozitiv apărut în urma folosirii acestei metode va fi anuntat imediat Institutului de igiena şi sănătate publică veterinara şi Agenţiei Naţionale Sanitare Veterinare. +
Capitolul 2Îndrumător pentru identificarea şi estimarea microscopica a constituentilor de origine animala din furaje1. Obiect şi domeniu de aplicareAcest ghid se va utiliza acolo unde detectarea constituentilor de origine animala (definiţi ca produse de la procesarea carcaselor sau părţilor acestora de la mamifere, păsări sau peşti) din furaje se efectuează prin examen microscopic.În cazul în care se cere şi o apreciere cantitativă a acestor constituenti, se vor urma instrucţiunile prevăzute la pct. 7.2. SensibilitateÎn funcţie de natura constituentilor (<0,1%).3. PrincipiuO proba reprezentativa, luată în acord cu prevederile impuse de Ordinul ministrului agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor nr. 390 din 15 octombrie 2001, va fi folosită după pregătire pentru identificare. Constituentii de origine animala sunt identificati pe baza caracterelor microscopice tipice (de exemplu: fibre musculare, părţi de oase sau cartilaje, fire de par, sânge, coaja de ou, oase de peste etc.). Identificarea se va face atât din filtrat (pct. 6.1), cat şi din sedimentul concentrat (pct. 6.2) al probei.4. Reactivi*):──────────Notă …
*) Reactivii listati sunt disponibili comercial dacă nu exista o alta menţiune.4.1. agenţi de clarificare:4.1.1. cloral hidrat (soluţie apoasa 60% v/v);4.1.2. ulei de parafina;4.2. agenţi de concentrare:4.2.1. tetracloretan (densitate 1,62);4.3. agenţi de colorare:4.3.1. reactiv Bradford;4.3.2. soluţie iod/iodura de potasiu;4.3.3. reactiv Millon;4.3.4. reactiv pentru cistina (2 g acetat de plumb şi 10 g NaOH/100 ml H(2)O).Reactivii listati pot fi înlocuiţi cu reactivi care dau rezultate asemănătoare.5. Echipament şi accesorii:5.1. balanţa analitica (d=0,001 g);5.2. dispozitiv de maruntire, macinare;5.3. site cu ochiuri de 0,1-2 mm;5.4. stereomicroscop cu magnificatie > 50';5.5. microscop compus (magnificatie > 400') cu lumina polarizata;5.6. sticlarie de laborator.6. ProceduraÎn funcţie de natura materialului (dacă este necesar, se marunteste), se iau cel puţin 10 g de proba şi se divid în doua părţi, una de cel puţin 5 g pentru partea filtrata (pct. 6.1) şi una de cel puţin 2 g pentru sedimentul concentrat (pct. 6.2). Colorarea cu agenţi de colorare (pct. 6.3) este recomandată pentru identificare.6.1. Identificarea constituentilor de natura animala în filtratO cantitate de minimum 5 g din proba este trecută prin site (pct. 5.3) în cel puţin două fractii.Fractia (fractiile) > 0,5 mm (sau o parte reprezentativa din fractie) se întinde în strat subtire pe un suport adecvat şi se cauta componentii de origine animala la stereomicroscopul (pct. 5.4) cu diferite puteri de marire.În stratul (straturile) <0,5 mm se cauta componentii de origine animala la microscopul compus (pct. 5.5) cu obiective diferite.6.2. Identificarea constituentilor din sediment concentratSe iau cel puţin 2 g (cantarite cu o precizie de 0,001 g) din proba, se introduc într-un flacon sau într-o palnie de separare şi se adauga 15 ml de tetracloretan (pct. 4.2.1). După omogenizare se agita conţinutul de mai multe ori şi apoi se lasă în repaus (cel puţin 1' şi nu mai mult de 2-3') pentru depunerea sedimentului.Se decanteaza supernatantul şi sedimentul este uscat la etuva şi cantarit repetat până la masa constanta (± 0,001 g). Cantarirea este necesară numai în cazul în care se face o apreciere cantitativă. Sedimentul se examinează în întregime sau în cota-parte pentru fragmente de oase, la stereomicroscop (pct. 5.4) şi la microscop (pct. 5.5).6.3. Utilizarea agenţilor de clarificare şi de colorareIdentificarea microscopica a constituentilor de origine animala se poate face prin utilizarea agenţilor speciali de clarificare şi colorare:● cloral hidrat (pct. 4.1.1) – prin încălzire uşoară structura celulara poate fi mult mai clara datorită gelatinizarii granulelor de amidon şi indepartarii particulelor nedorite;● ulei de parafina (pct. 4.1.2) – componentele oaselor pot fi identificate datorită faptului ca majoritatea porilor rămân umpluti cu aer şi apar ca spaţii negre cu diametrul de ~ 5-15 æm;● reactivul Bradford (pct. 4.3.1) – este utilizat pentru detectarea proteinelor (culoare specifică albastra). Se dilueaza cu apa 1:4;● soluţia de iod/iodura de potasiu (pct. 4.3.2) – este utilizata pentru identificarea amidonului (culoare albastra-violeta) şi a proteinelor (culoare galben-portocalie). Se dilueaza dacă este necesar;● reactivul Millon (pct. 4.3.3) – prin încălzire uşoară componentele osoase capata o culoare roz;● reactivul pentru cistina (pct. 4.3.4) – prin încălzire uşoară constituentii care conţin cistina (par, fanere etc.) capata o culoare neagra-maronie.7. Calcul şi evaluareÎn cazul în care estimarea cantitativă este necesară, se va proceda conform acestui punct.Calculul poate fi făcut doar dacă constituentii conţin fragmente de oase. Fragmentele de oase de la animale terestre homeoterme (mamifere şi păsări) pot fi deosebite de oasele de peste prin examen microscopic, pe baza vizualizarii lacunelor tipice. Proporţia de constituenti de origine animala se poate calcula ţinând seama de:– proporţia estimată (masa, în %) de fragmente osoase din sediment; şi– proporţia (masa, în %) de oase în constituentii de origine animala.Estimarea se face pe baza a cel puţin 3 (dacă este posibil) până la 5 câmpuri pentru un strat. În nutreturile combinate, de regula, sedimentul nu conţine numai fragmente de oase, ci şi alte componente cu greutate specifică mare, de exemplu: minerale, nisip, fragmente vegetale lignificate.7.1. Calculul procentual al fragmentelor de oase: S x c Fragmente de oase % = ───── (animale terestre) W S x d Fragmente de oase = ────── , şi solzi % (peste) Wîn care:S = masa sedimentului (mg); c = factor de corectie (%) pentru estimarea procentului de oase animale în sediment; d = factor de corectie (%) pentru estimarea procentului de oase de peste şi solzi în sediment; W = masa probei prelucrate pentru sedimentare (mg).7.2. Estimarea valorii pentru constituenti de origine animalaProporţia de oase în produsele animale este variabila. În cazul fainii de oase procentul este de 50-60%, iar în cazul fainii de carne, de 20-30%; la făina de peste procentul de oase şi solzi este variabil în funcţie de specie, în general de 10-20%.Dacă se cunoaşte specia de la care provine produsul, se poate calcula conţinutul estimat.Conţinutul estimat de constituenti de la animale terestre (%) = S x c ────── x 100 W x f Conţinutul estimat de constituenti de peste (%) = S x d ───── x 100, W x f în care:S = masa sedimentului (mg); c = factor de corectie (%) pentru estimarea procentului de oase animale în sediment; d = factor de corectie (%) pentru estimarea procentului de oase de peste şi solzi în sediment; f = factorul de corectie pentru proporţia de oase din constituentii de origine animala din proba; W = masa probei prelucrate pentru sedimentare (mg).8. Exprimarea rezultatelorPot exista următoarele situaţii:8.1. la capacitatea de identificare la microscop nu exista constituenti de origine animala (asa cum sunt definiţi la pct. 1) în proba analizata;8.2. la capacitatea de identificare la microscop exista constituenti de origine animala *) în proba analizata.În acest caz raportul examinării poate fi specificat astfel:8.2.1. la capacitatea de identificare la microscop exista cantităţi mici de constituenti de origine animala *) în proba analizata;──────────────Notă …
*) Tipul constituentilor identificati, de exemplu oase (peste sau animale), constituenti din carne etc., trebuie să fie indicat.8.2.2. în funcţie de experienta analistului:– exista constituenti de origine animala. Conţinutul de fragmente de oase (peste/animale terestre);– în cazul fragmentelor de oase de la animale terestre, eventual specificat de la păsări sau mamifere (vezi pct. 9.3), este estimat un ordin de marire de ……… %, egal cu ……….% constituenti animali, când se calculează în baza a ………… % oase în constituenti animali, utilizându-se factorul de corectie f; sau– au fost gasiti constituenti de origine animala în cantităţi masurabile.Pentru situaţiile prevăzute la pct. 8.2, 8.2.1 şi 8.2.2, când oasele animalelor terestre au fost identificate, raportul trebuie să conţină date suplimentare. Posibilitatea ca următorii constituenti să fie derivati de la mamifere nu poate fi exclusa.Aceasta clauza nu este necesară dacă fragmentele de oase de la animale terestre au fost identificate ca aparţinând pasarilor sau mamiferelor (vezi pct. 9.3).9. Recomandări9.1. Se recomanda ca în cazul constituentilor voluminosi şi în cantitate mare sedimentul obţinut la filtrare să fie împărţit în doua fractii (de exemplu, utilizarea unei site cu ochiuri de 320 æm). Fracţiunea cu constituenti voluminosi poate fi examinata ca preparat cu ulei de parafina, iar fracţiunea cu particule fine trebuie examinata la microscop.9.2. Sedimentul concentrat (pct. 6.2), dacă este necesar, poate fi divizat mai departe utilizându-se un agent de concentrare cu densitate mai mare.9.3. În funcţie de experienta analistului identificarea originii poate fi facuta utilizându-se un preparat specific histologic prin care poate fi facuta aceasta identificare.────────────────
