ORDIN nr. 1.020 din 17 decembrie 2002

privind aprobarea Metodei de analiza de referinţa pentru detectarea laptelui de vacă şi a cazeinatilor din lapte de vacă în branzeturile produse din lapte de oaie, lapte de capra sau lapte de bivolita ori din amestecuri de lapte de oaie, capra şi bivolita



Vazand Referatul de aprobare nr. 132.534 din 5 noiembrie 2002 al Direcţiei generale de elaborare şi armonizare a politicilor, strategiilor şi programelor,având în vedere prevederile art. 38 alin. (9) lit. b) din Ordonanţa de urgenta a Guvernului nr. 97/2001 privind reglementarea producţiei, circulaţiei şi comercializării alimentelor, aprobată cu modificări prin Legea nr. 57/2002,în temeiul Hotărârii Guvernului nr. 362/2002 privind organizarea şi funcţionarea Ministerului Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor, cu modificările şi completările ulterioare, al Hotărârii Guvernului nr. 22/2001 privind organizarea şi funcţionarea Ministerului Sănătăţii şi Familiei, cu modificările şi completările ulterioare, şi al Hotărârii Guvernului nr. 166/2001 privind organizarea şi funcţionarea Autorităţii Naţionale pentru Protecţia Consumatorilor, cu modificările ulterioare,ministrul agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor, ministrul sănătăţii şi familiei şi preşedintele Autorităţii Naţionale pentru Protecţia Consumatorilor emit următorul ordin: + 
Articolul 1Se aprobă Metoda de analiza de referinţa pentru detectarea laptelui de vacă şi a cazeinatilor din lapte de vacă în branzeturile produse din lapte de oaie, lapte de capra sau lapte de bivolita ori din amestecuri de lapte de oaie, capra şi bivolita, prevăzută în anexa care face parte integrantă din prezentul ordin. + 
Articolul 2Metoda de analiza de referinţa se aplică în laboratoarele oficiale ale autorităţilor competente pentru executarea controlului oficial al alimentelor, stabilite prin art. 38 din Ordonanţa de urgenta a Guvernului nr. 97/2001 privind reglementarea producţiei, circulaţiei şi comercializării alimentelor, aprobată cu modificări prin Legea nr. 57/2002. + 
Articolul 3Agenţii economici care produc şi/sau comercializează branzeturi ale căror denumire şi compoziţie, menţionate pe eticheta sau în declaraţia de conformitate cu specificăţia tehnica, nu corespund cu rezultatele analizelor de laborator se sancţionează de către autorităţile menţionate în art. 2, conform art. 41-43 din Ordonanţa de urgenta a Guvernului nr. 97/2001, aprobată cu modificări prin Legea nr. 57/2002. + 
Articolul 4Ministerul Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor, Ministerul Sănătăţii şi Familiei, Autoritatea Naţionala pentru Protecţia Consumatorilor, agenţii economici care desfăşoară activităţi de producere şi comercializare a branzeturilor vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin. + 
Articolul 5Prezentul ordin se publică în Monitorul Oficial al României, Partea I, şi intră în vigoare la 1 ianuarie 2004.Ministrul agriculturii,alimentaţiei şi pădurilor,Ilie Sarbup. Ministrul sănătăţii şi familiei,Radu Deac,secretar de statPreşedintele Autorităţii Naţionalepentru Protecţia Consumatorilor,Rovana Plumb,secretar de stat + 
AnexăMETODA DE ANALIZA DE REFERINŢApentru detectarea laptelui de vacă şi a cazeinatilordin lapte de vacă în branzeturile produse din lapte de oaie,lapte de capra sau lapte de bivolita ori din amestecuride lapte de oaie, capra şi bivolitaI. Generalitati1.1. Metoda de analiza de referinţa se utilizează în vederea garantarii faptului ca branza care trebuie produsă exclusiv din lapte de oaie, lapte de capra sau lapte de bivolita ori dintr-un amestec de lapte de oaie, capra şi bivolita nu conţine de fapt cazeina din lapte de vacă.1.2. Se considera ca este prezenta cazeina din lapte de vacă dacă conţinutul aparent de cazeina din lapte de vacă al probei analizate este mai mare sau egal cu conţinutul probei de referinţa descrise, care conţine 1% lapte de vacă.2. Metodele de rutina folosite pentru detectarea cazeinei din lapte de vacă în branzeturile menţionate la pct. 1 se utilizează în următoarele condiţii:a) limita de detectare trebuie să fie de 0,5% sau mai mica; … b) nu apar rezultate fals-pozitive. Dacă aceasta condiţie nu este îndeplinită, orice proba pentru care s-a obţinut un rezultat pozitiv trebuie analizata prin metoda de referinţa; … c) cazeina din laptele de vacă trebuie să poată fi detectata cu sensibilitatea cerută chiar şi după perioade lungi de maturare, asa cum se poate intampla în condiţii comerciale normale. Dacă aceasta condiţie nu este îndeplinită pentru un anumit tip de branza menţionat la pct. 1, branza respectiva trebuie analizata prin metoda de referinţa. … II. Descrierea metodei1. ObiectDetectarea laptelui de vacă şi a cazeinei în branzeturile produse din lapte de oaie, lapte de capra, lapte de bivolita sau din amestecuri de lapte de oaie, capra şi bivolita prin focalizarea izoelectrica a g-cazeinelor după plasminoliza2. Domeniu de aplicarePrezenta metoda poate fi folosită pentru detectarea sensibila şi specifică a laptelui de vacă şi a cazeinatului natural sau tratat termic în branzeturile proaspete şi maturate produse din lapte de oaie, lapte de capra, lapte de bivolita sau din amestecuri de lapte de oaie, capra şi bivolita. Nu poate fi folosită pentru detectarea falsificării laptelui şi a branzei cu concentrate de proteine de zer de vacă tratate termic.3. Principiu3.1. Izolarea cazeinei din branza şi din probele de referinţa3.2. Dizolvarea cazeinelor izolate şi tratarea acestora prin clivare plasminica (EC.3.4.21.7)3.3. Focalizarea izoelectrica a cazeinelor tratate cu plasmina în prezenta ureii şi colorarea proteinelor3.4. Evaluarea benzilor colorate de γ2 – şi γ3 -cazeina (dovezi ale prezentei laptelui de vacă) prin compararea benzilor obţinute din proba cu benzile obţinute pe acelaşi gel din probele de referinţa conţinând 0% şi 1% lapte de vacă.4. ReactiviÎn afară cazurilor menţionate explicit, produsele chimice obţinute trebuie să fie de puritate analitica. Apa folosită trebuie să fie bidistilata sau de o puritate echivalenta.Observatie: Următoarele detalii se aplică gelurilor de poliacrilamide cu conţinut de uree preparate în laborator, cu dimensiunile de 265 x 125 x 0,25 mm. Dacă se folosesc geluri de alte dimensiuni sau tipuri, se poate dovedi necesară schimbarea condiţiilor de separare.Focalizarea izoelectrica4.1. Reactivi pentru producerea gelurilor de poliacrilamide cu conţinut de uree4.1.1. Prepararea soluţiei "de baza" de gelSe dizolva în apa:4,85 g acrilamida0,15 g N, N'-metilen-bis-acrilamida (BIS)48,05 g uree15,00 g glicerina (87% m/m)şi se completează cu apa până la 100 ml, apoi se păstrează produsul obţinut în frigider, într-un recipient din sticlă de culoare închisă.Observatie: În locul cantităţilor fixe de acrilamide neurotoxice menţionate mai sus se poate folosi o soluţie de acrilamida/BIS prefabricata care poate fi gasita în comerţ. Dacă o astfel de soluţie conţine 30% m/v acrilamida şi 0,8% m/v BIS, cantităţile de acrilamida şi BIS din preparatul de mai sus se înlocuiesc cu 16,2 ml de soluţie. Termenul de valabilitate a soluţiei "de baza" este de maximum 10 zile; dacă conductibilitatea acesteia este mai mare de 5 μS, se deionizeaza substanţa prin agitare cu 2 g Amberlite MB-3 timp de 30 de minute, apoi se filtreaza printr-o membrana de 0,45 μm.4.1.2. Soluţia de gelSe prepara o soluţie de gel amestecandu-se aditivii şi amfolitii cu soluţia "de baza" de gel (vezi pct. 4.1.1):9,0 ml soluţie "de baza"24 mg beta-alanina500 μl amfolit pH 3,5-9,5*1)250 μl amfolit pH 5-7*1)250 μl amfolit pH 6-8*1)––––*1) Produsele Ampholine(R) pH 3,5-9,5 (Pharmacia) and Resolyte(R) pH 5-7 şi pH 6-8 (BDH, Merck) s-au dovedit deosebit de folositoare pentru obţinerea gradului necesar de separare a γ-cazeinelor.Se amesteca soluţia de gel şi se degazeifica timp de doua sau trei minute într-o baie cu ultrasunete sau sub vid.Observatie: Soluţia de gel se prepara imediat înainte de a se turna (vezi pct. 6.2).4.1.3. Catalizatori:4.1.3.1. N, N, N' N' – tetrametiletilendiamina (Temed)4.1.3.2. 40% m/v persulfat de amoniu (PER)Se dizolva 800 mg PER în apa şi se completează cu apa până la 2 ml.Observatie: A se folosi întotdeauna soluţie PER proaspăt preparata.4.2. Fluid de contact: kerosen sau parafina lichidă4.3. Soluţie anodica: se dizolva în apa 5,77 g acid fosforic (85% m/m) şi se dilueaza până la 100 ml.4.4. Soluţie catodica: se dizolva în apa 2,00 g hidroxid de sodiu şi se dilueaza până la 100 ml.Prepararea probei4.5. Reactivi pentru izolarea proteinelor4.5.1. Se dilueaza acid acetic (25,0 ml acid acetic glacial completat cu apa până la 100 ml)4.5.2. Clorura de metilen4.5.3. Acetona4.6. Soluţie tampon de dizolvare a proteineiSe dizolva în apa:5,75 g glicerina (87% m/m)24,03 g uree250 mg ditiotreitolşi se completează cu apa până la 50 ml.Observatie: Se păstrează substanţa în frigider; termen de valabilitate: maximum o săptămâna.4.7. Reactivi pentru clivarea plasminica a cazeinelor4.7.1. Soluţie tampon de carbonat de amoniuSe titreaza până la pH 8 o soluţie de bicarbonat de amoniu 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml apa) conţinând acid etilendiaminotetraacetic 0,05 mol/l (EDTA, 1,46 g/100 ml), cu o soluţie de carbonat de amoniu 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml apa) conţinând 0,05 mol/l EDTA.4.7.2. Plasmina bovina (EC 3.4.21.7), cu activitate de minimum 5 U/ml4.7.3. Soluţie de acid epsilon-aminocaproic pentru inhibarea enzimelorSe dizolva 2,624 g acid epsilon-aminocaproic (acid 6-amino-n-hexanoic) în 100 ml de etanol 40% (v/v).4.8. Probe de referinţa4.8.1. De la Institutul pentru Materiale şi Măsurători de Referinţa al Comunităţii, B-2440 Geel, Belgia, pot fi obţinute probe de referinţa certificate, obţinute din amestecuri de lapte degresat de oaie şi capra conţinând 0%, respectiv 1% lapte de vacă.4.8.2. Prepararea probelor de referinţa provizorii de laborator din lapte de bivolita inchegat conţinând 0% şi 1% lapte de vacăLaptele degresat se prepara prin centrifugarea laptelui crud de bivolita sau de vacă vrac la 37°C (2.500 g, timp de 20 de minute). După racirea rapida a tubului şi a conţinutului la 6-8°C stratul superior de grasime se indeparteaza în totalitate. Pentru prepararea probei standard 1% se adauga 5,00 ml lapte de vacă degresat la 495 ml lapte de bivolita degresat într-un vas de 1 l, se ajusteaza pH-ul la 6,4 prin adăugarea de acid lactic diluat (10% m/v). Se ajusteaza temperatura la 35°C şi se adauga 100 μl cheag de vitel (activitatea reninica 1:10000, c. 3000 U/ml), se amesteca timp de 1 minut, apoi se acoperă vasul cu o folie de aluminiu şi se lasă la 35°C timp de o ora pentru a se forma coagulul. După formarea acestuia laptele inchegat este liofilizat în întregime fără omogenizare prealabilă şi fără a se extrage zerul. După liofilizare produsul se zdrobeste până se obţine o pulbere fina omogenă. Pentru prepararea probei standard 0% se urmează aceeaşi procedura, folosindu-se lapte degresat de bivolita veritabil. Probele trebuie păstrate la -20°C.Observatie: Înaintea preparării probelor standard se recomanda verificarea puritatii laptelui de bivolita prin focalizarea izoelectrica a cazeinelor tratate cu plasmina.Reactivi pentru colorarea proteinelor4.9. Fixator: se dizolva în apa 150 g acid tricloroacetic şi se completează cu apa până la 1.000 ml.4.10. Soluţie pentru decolorare: se dilueaza cu apa distilata până la 2.000 ml 500 ml metanol şi 200 ml acid acetic glacial.Observatie: Se prepara zilnic o soluţie proaspăta de decolorare; soluţia poate fi preparata prin amestecarea de volume egale de soluţii "de baza" metanol 50% (v/v) şi acid acetic glacial 20% (v/v).4.11. Soluţii pentru colorare4.11.1. Soluţie pentru colorare (soluţie "de baza" 1)Se dizolva 3,0 g Albastru Briliant de Coomassie G-250 (C.I. 42655) în 1.000 ml metanol 90% (v/v), folosindu-se un agitator magnetic (timp de aproximativ 45 de minute), apoi se filtreaza prin doua filtre cutate de hârtie cu porozitate medie.4.11.2. Soluţie pentru colorare (soluţie "de baza" 2)Se dizolva 5,0 g sulfat de cupru (pentahidrat în 1.000 ml acid acetic 20% (v/v).4.11.3. Soluţie pentru colorare (soluţie de lucru)Se amesteca 125 ml din fiecare soluţie "de baza" (pct. 4.11.1, 4.11.2) imediat înainte de colorare.Observatie: Se recomanda prepararea soluţiei de colorare în ziua folosirii acesteia.5. Aparatura5.1. Plăci de sticlă (265 x 125 x 4 mm); rola de cauciuc (latime 15 cm), masa reglabila5.2. Foi sustinatoare de gel (265 x 125 mm)5.3. Foaie de acoperire (280 x 125 mm). Se lipeşte o bucata de banda adeziva (280 x 6 x 0,25 mm) pe fiecare latura lungă (vezi figura 1).5.4. Cuva de electrofocalizare cu placa de răcire (de exemplu: 265 x 125 mm) cu unitate de alimentare electrica adecvată (≥ 2,5 kV) sau cu aparat automat de electroforeza5.5. Criostat de circulaţie reglabila la 12±0,5°C5.6. Centrifuga care poate realiza 3.000 g5.7. Benzi de electrozi (≥ 265 mm)5.8. Sticle picuratoare de plastic pentru soluţiile anodice şi catodice5.9. Aplicatoare de probe (10 x 5 mm, viscoza sau hârtie de filtru cu absorbţie redusă a proteinelor)5.10. Foarfece, scalpele şi pensete din oţel inoxidabil5.11. Cuve din oţel inoxidabil pentru colorare şi decolorare (de exemplu: tavi de 280 x 150 mm)5.12. Omogenizator ajustabil cu tija (diametrul tijei 10 mm), viteza de rotaţie 8.000-20.000 rpm5.13. Agitator magnetic5.14. Baie cu ultrasunete5.15. Aparat de sudura a foliilor5.16. Micropipete de 25 μl5.17. Concentrator sub vid sau liofilizator5.18. Baie de apa cu agitator, reglabila şi care poate realiza 35 şi 40±1°C5.19. Echipament de densitometrie cu citire la lambda = 634 nm6. Procedura de testare6.1. Prepararea probei6.1.1. Izolarea cazeinelorSe cantareste într-un tub de centrifuga de 100 ml echivalentul a 5 g materie uscata de branza sau proba de referinţa, se adauga 60 ml apa distilata şi se omogenizeaza cu un omogenizator cu tija (8.000-10.000 rpm). Se ajusteaza la un pH de 4,6 cu o soluţie de acid acetic diluat (pct. 4.5.1) şi se pune în centrifuga (5 minute, 3.000 g). Se decanteaza grasimea şi zerul, se omogenizeaza reziduul la 20.000 rpm în 40 ml apa distilata ajustata la un pH de 4,5 cu soluţie de acid acetic diluat (pct. 4.5.1), se adauga 20 ml diclorometan (pct. 4.5.2), se omogenizeaza din nou şi se pune în centrifuga (5 minute, 3.000 g). Se indeparteaza cu o spatula stratul de cazeina care se afla între faza apoasa şi cea organică (vezi figura 2) şi se elimina ambele faze. Se reomogenizeaza cazeina în 40 ml apa distilata (vezi mai sus) şi în 20 ml diclorometan (pct. 4.5.2), apoi se pune în centrifuga. Se repeta procedura până când ambele faze extrase sunt incolore (de doua sau trei ori). Se omogenizeaza reziduul de proteina cu 50 ml acetona (pct. 4.5.3) şi se filtreaza printr-un filtru cutat cu hârtie de porozitate medie. Se spala de fiecare data reziduul de pe filtru cu câte doua portii separate de 25 ml acetona şi se lasă să se usuce în aer sau în curent de azot, apoi se transforma în pulbere într-un mojar.Observatie: Cazeina izolata uscata trebuie păstrată la -20°C.6.1.2. Clivarea plasminica a beta-cazeinelor pentru intensificarea γ-cazeinelorSe prepara o suspensie de 25 mg cazeine izolate (pct. 6.1.1) în 0,5 ml soluţie tampon de carbonat de amoniu (pct. 4.7.1) şi se omogenizeaza timp de 20 de minute, folosindu-se, de exemplu, tratamentul ultrasonic. Se incalzeste la 40°C şi se adauga 10 μl plasmina (pct. 4.7.2), apoi se amesteca şi se incubeaza timp de o ora la 40°C, agitand incontinuu. Pentru a inhiba enzimele se adauga 20 μl soluţie de acid epsilon-aminocaproic (pct. 4.7.3), apoi se adauga 200 mg uree solida şi 2 mg ditiotreitol.Observatie: Pentru a obţine o simetrie mai mare a benzilor cazeinice focalizate se recomanda liofilizarea soluţiei după adăugarea acidului epsilon-aminocaproic şi dizolvarea reziduurilor în 0,5 ml soluţie tampon pentru dizolvarea proteinelor (pct. 4.6).6.2. Prepararea gelurilor poliacrilamide care conţin ureeCu ajutorul catorva picaturi de apa se întinde foaia sustinatoare de gel (pct. 5.2) pe o placa de sticlă (pct. 5.1), indepartandu-se surplusul de apa cu un servetel. Se întinde în mod similar foaia de acoperire (pct. 5.3) cu spatiatoare (0,25 mm) pe o alta placa de sticlă. Se asaza placa orizontal pe masa reglabila.Se adauga 10 μl Temed (pct. 4.1.3.1) la soluţia de gel degazeificata pregatita (pct. 4.1.2), se amesteca şi se adauga 10 μl soluţie PER (pct. 4.1.3.2), se amesteca bine şi se toarna imediat amestecul într-un strat egal pe centrul foii de acoperire. Se pune o margine a placii sustinatoare de gel (cu faţa foii îndreptată în jos) pe placa de acoperire şi se coboară incet, astfel încât între foi să se formeze un strat subtire de gel care să se intinda uniform şi fără bule (figura 3). Se coboară cu grija până la capăt placa sustinatoare de gel, folosindu-se o spatula subtire, apoi se asaza încă trei plăci de sticlă deasupra, pentru a acţiona ca greutate. După încheierea polimerizarii (în jur de 60 minute) se transfera gelul polimerizat împreună cu foaia de acoperire pe foaia sustinatoare de gel, inclinandu-se plăcile de sticlă. Se curata cu grija spatele foii sustinatoare de gel pentru a se elimina reziduurile de gel şi de uree. Se sudeaza marginile "sandvisului" de gel astfel încât să se obţină un tub şi se păstrează în frigider (timp de maximum 6 săptămâni).Observatie: Foaia de acoperire şi spatiatoarele pot fi refolosite. Gelul de poliacrilamida poate fi tăiat la dimensiuni mai mici, acţiune care este recomandată în cazul în care exista puţine probe sau dacă se foloseşte un aparat automat de electroforeza (doua geluri format 4,5 x 5 cm).6.3. Focalizarea izoelectricaSe regleaza termostatul de răcire la 12°C. Se şterge cu kerosen spatele foii sustinatoare de gel, apoi se picura câteva picaturi de kerosen (pct. 4.2) pe centrul blocului de răcire. Se ruleaza apoi pe el "sandvisul" de gel, cu partea sustinatoare de gel îndreptată în jos, avându-se grija să se evite formarea bulelor. Se şterge excesul de kerosen şi se indeparteaza foaia de acoperire. Se imbiba benzile de electrozi în soluţiile electrolitice (pct. 4.3, 4.4), se taie după lungimea gelului şi se plaseaza în poziţia prevăzută (distanta dintre electrozi de 9,5 cm).Condiţii pentru focalizarea izoelectrica:6.3.1. Dimensiunile gelului 265 x 125 x 0,25 mm

–––*1) Aplicarea probei: după prefocalizare (pasul 1) se picura 18 μl din proba şi din soluţiile standard pe aplicatorii probei (10 x 5 mm), se plaseaza aplicatorii pe gel la distanta de 1 mm unul de celălalt şi la 5 mm longitudinal faţă de anod şi se apasa uşor. Procedura de focalizare se finalizează în condiţiile specificate mai sus, indepartandu-se cu grija aplicatorii probei după 60 de minute de focalizare a probei.Observatie: Dacă se schimba grosimea sau lăţimea gelurilor, atunci intensitatea şi puterea curentului trebuie ajustate în consecinţa (e.g. dacă se foloseşte un gel de 265 x 125 x 0,5 mm se dublează valorile pentru intensitatea şi puterea curentului electric).6.3.2. Exemplu de program de voltaj pentru un aparat automat de electroforeza (doua geluri de 5,0 x 4,5 cm), cu electrozi fără benzi şi aplicati direct pe gel

Se plaseaza aplicatorul probei la pasul 2 la 0 Vh.Se indeparteaza aplicatorul probei la pasul 2 la 30 Vh.6.4. Colorarea proteinelor6.4.1. Fixarea proteinelorSe indeparteaza benzile de electrozi imediat după stingerea aparatului şi se plaseaza imediat gelul într-o cuva de colorare/decolorare umpluta cu 200 ml fixator (pct. 4.9); se lasă acolo timp de 15 minute, agitand continuu.6.4.2. Spalarea şi colorarea placii de gelSe scurge cu grija fixatorul şi se spala placa de gel de doua ori, timp de câte 30 de secunde, cu 100 ml soluţie decoloranta (pct. 4.10). Se decanteaza soluţia decoloranta şi se umple cuva cu 250 ml soluţie coloranta (pct. 4.11.3); se lasă 45 de minute să se coloreze, agitandu-se uşor cuva.6.4.3. Decolorarea placii de gelSe decanteaza soluţia coloranta, se spala placa de gel de doua ori, cu câte 100 ml soluţie decoloranta (pct. 4.10), apoi se agita timp de 15 minute cu 200 ml soluţie decoloranta şi se repeta pasul de decolorare de cel puţin două-trei ori, până când fundul vasului este curatat şi incolor. Se clateste apoi cu apa distilata placa de gel (2 x 2 minute) şi se usucă la aer (2-3 ore) sau cu un uscator de par (10-15 minute).Observatie 1: Fixarea, spalarea, colorarea şi decolorarea se efectuează la 20°C. A nu se folosi temperaturi ridicate.Observatie 2: Dacă se prefera colorarea mai sensibila cu argint (e.g. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, cod nr. 17-1150-01), probele de cazeina tratate cu plasmina trebuie diluate la 5 mg/ml.7. Interpretarea rezultatelorEvaluarea este efectuată prin compararea benzilor de proteine ale probei necunoscute cu probele de referinţa efectuate pe acelaşi gel. Detectarea laptelui de vacă în branzeturile din lapte de oaie, lapte de capra şi lapte de bivolita şi în amestecurile de lapte de oaie, capra şi bivolita se face prin intermediul γ3 – şi γ2 -cazeinelor, ale căror puncte izoelectrice se afla în intervalul pH 6,5-7,5 (figurile 4a, 4b şi 5). Limita de detectie este mai mica de 0,5%.7.1. Interpretare vizualaPentru evaluarea vizuala a cantităţii de lapte de vacă se recomanda ajustarea concentratiilor probelor şi a probelor standard pentru a se obţine acelaşi nivel de intensitate a γ3 – şi γ2 -cazeinelor din laptele de ovine, caprine şi/sau bivolite (vezi "γ2-E, G, B" şi "γ3-E, G, B" din figurile 4a, 4b şi 5). După aceasta nivelul de lapte de vacă (mai mic decât, egal cu sau mai mare de 1%) din proba necunoscută poate fi estimat direct, prin compararea intensitatii γ3 şi γ2-cazeinelor din laptele de vacă (vezi "γ3-C" şi "γ2-C" din figurile 4a, 4b şi 5) cu cea a probelor de referinţa de 0% şi 1% (oaie, capra) sau cu standardele provizorii de laborator (bivolita).7.2. Interpretare densitometricaDacă este disponibilă, se aplică densitometria (pct. 5.19) pentru determinarea raportului dintre suprafaţa vârfurilor γ3 – şi γ2 -cazeinelor din laptele de vacă, respectiv din laptele de oaie, capra şi/sau bivolita (vezi figura 5). Aceasta valoare se compara cu raportul dintre suprafaţa vârfurilor γ3 – şi γ2 -cazeinelor pentru proba de referinţa 1% (oaie, capra) sau pentru standardul provizoriu de laborator (bivolita), analizate pe acelaşi gel.Observatie: Metoda funcţionează corespunzător dacă se obţine un semnal pozitiv clar pentru ambele cazeine γ3 – şi γ2 – din proba de referinţa 1%, dar nu şi din proba de referinţa 0%. Dacă nu, procedura trebuie îmbunătăţită respectându-se cu exactitate detaliile acestei metode.O proba este considerată pozitiva dacă ambele cazeine bovine γ3 – şi γ2 – sau raportul suprafeţei vârfurilor corespunzător sunt mai mari sau egale cu nivelul din proba de referinţa 1%.–––––––––Figura 1. Schita foii de acoperire Figura 2. Strat de cazeina plutind între faza apoasa şi faza organicăFigura 3. Tehnica de pliere pentru obţinerea filmului de gela. – bandă adezivă pentru spaţiere (0,25 mm)b. – foaie de acoperire (5.3)c, e. – plăci de sticlă (5.1)d. – soluţie de gel (4.1.2)f. – foaie susţinătoare de gel (5.2)CFigura 4a. Focalizare izoelectrica a cazeinelor tratate cu plasmina din brânza provenită din lapte de oaie şi de capra, conţinând diferite cantităţi de lapte de vacă.% CM = procent de lapte de vacăC = vacă; E = oaie; G = capră.Este ilustrată jumătatea de sus a gelului.Figura 4b. Focalizare izoelectrica a cazeinelor tratate cu plasmina din branza provenită din amestec de lapte de oaie, capra şi bivolita, conţinând diferite cantităţi de lapte de vacă.% CM = procent de lapte de vacă1 + – proba conținând 1% lapte de vacă și dopată cu cazeină pură bovină la mijlocul traiectului geluluiC = vacă; E = oaie; G = capră.Este ilustrată distanţa totală de separare a gelului IEF.Figura 5. Suprapunerea densitogramelor probelor standard (STD) şi a probelor preparate din amestec de lapte de oaie şi de capra după focalizare izoelectrica.a, b – probe standard conținând 0 și 1 % lapte de vacă.c, d – probe de brânză coținând 0, 1, 2, 3 și 7 % lapte de vacă.C = vacă; E = oaie; G = capră.Jumătatea superioară a gelului IEF a fost scanat la lambda = 634 nm.––––

	Redacția Lex24 Drept la Sursa!
	Articole Urmărește