ce stabileşte metode naţionale de analiză pentru controlul oficial al furajelor în scopul identificării conţinutului în halofuginonă*)(actualizată până la data de 21 februarie 2007**)
–––––**) Forma actualizată a acestui act normativ până la data de 21 februarie 2007 este realizată de către Departamentul juridic din cadrul S.C. "Centrul Teritorial de Calcul Electronic" S.A. Piatra-Neamţ prin includerea tuturor modificărilor şi completărilor aduse de către ORDINUL nr. 21 din 1 februarie 2007.Conţinutul acestui act nu este un document cu caracter oficial, fiind destinat pentru informarea utilizatorilor*) Aprobată prin Ordinul nr. 21 din 10 iunie 2004, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1020 din 4 noiembrie 2004. +
Articolul 1Analizele pentru conţinutul în halofuginonă în scopul controlului oficial al furajelor trebuie să fie efectuate utilizând metodele descrise de anexa la prezenta normă veterinară. +
Articolul 2(1) Autoritatea veterinară centrală a României poate adopta acte normative sau prevederi administrative suplimentare prezentei norme veterinare, pentru a dispune implementarea şi respectarea prevederilor acesteia. … (2) Autoritatea veterinară centrală va lua măsurile necesare şi va sancţiona, potrivit legii, orice încălcare a prevederilor prezentei norme veterinare. … (3) Atunci când autoritatea veterinară centrală a României adoptă cele menţionate la alineatele precedente, trebuie să se facă o referire expresă la prezenta normă veterinară. … +
Anexa ––la norma veterinară––––––-DETERMINAREA HALOFUGINONEIDL-trans-7-bromo-6-cloro-3-[3-(3-hidroxi-2-piperidil)acetonil]-quinazolin-4-(3H)-1 bromhidrat1. Scop şi aplicabilitateAceastă metodă are ca scop determinarea halofuginonei din furaje. Limita minimă a determinării este de 1 mg/kg.2. PrincipiuDupă tratare cu apă fierbinte, halofuginona este extrasă ca bază liberă în acetat de etil şi după aceea separată ca şi clorhidrat, într-o soluţie acidă apoasă. Extractul este purificat prin cromatografie de schimb ionic.Conţinutul în halofuginonă este determinat prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă în faza inversă (RP-HPLC) ce utilizează un detector cu UV.3. Reactivi3.1. Acetonitril, grade HPLC3.2. Rasina Amberlite XAD-23.3. Acetat de amoniu3.4. Acetat de etil3.5. Acid acetic glacial3.6. Substanţa standard halofuginonă (DL-trans-7-bromo-6-cloro-3-[3-(3- hidroxi-2-piperidil) acetonil]-quinazolin-4-(3H)-1 bromhidrat, E 764)3.6.1. Soluţie standard (etalon) stoc de halofuginonă, 100 mg/ml.Se cântăresc, cu aproximaţie de 0,1 mg, 50 mg halofuginonă (3.6) într-un balon cotat de 500 ml, se dizolvă în soluţie tampon de acetat de amoniu (3.18), se aduce la semn cu soluţie tampon şi se amestecă. Această soluţie este stabilă timp de 3 săptămâni, la 5°C dacă este păstrată la întuneric.3.6.2. Calibrarea (etalonarea) soluţiilorÎntr-o serie de baloane cotate de 100 ml se transferă 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 şi 6,0 ml din soluţia standard (etalon) stoc (3.6.1). Se aduce la semn cu faza mobila (3.2.1) şi se amestecă.Aceste soluţii corespund concentraţiilor de 2,0, 3,0, 4,0, şi 6,0 mg/ml de halofuginonă. Aceste soluţii trebuie să fie proaspăt preparate, înainte de utilizare.3.7. Acid clorhidric (r 20 aproximativ 1,16 g/ml)3.8. Metanol3.9. Azotat de argint3.10. Ascorbat de sodiu3.11. Carbonat de sodiu3.12. Clorură de sodiu3.13. EDTA (sare disodică a acidului etilendiamintetraacetic)3.14. Apă distilată grade HPLC3.15. Soluţie de carbonat de sodiu, v = 10 g/100 ml3.16. Soluţie de carbonat de sodiu saturata în clorura de sodiu, v = 5 g/100 mlSe dizolvă 50 g carbonat de sodiu (3.11) în apă, se diluează până la 1 litru şi se adaugă clorura de sodiu (3.12) până când soluţia devine saturată.3.17. Acid clorhidric, aproximativ 0,1 mol/lSe diluează 10 ml HCl (3.7) cu apă până la 1 litru.3.18. Soluţie tampon de acetat de amoniu, aproximativ 0,25Se dizolvă 19,3 g acetat de amoniu (3.3) şi 30 ml acid acetic (3.5) în apă (3.14) şi se diluează până la 1 litru.3.19. Prepararea răşinii Amberlite XAD-2Se spală o cantitate corespunzătoare de Amberlite (3.2) cu apă până se elimină toţi ionii de clorură, aşa cum este indicat printr-un test cu nitrat de argint efectuat în faza apoasă eliminată. Apoi se spală rasina cu 50 ml metanol (3.8), se înlătură metanolul şi se păstrează rasina în metanol proaspăt.3.20. Soluţie nitrat de argint, aproximativ 0,1 mol/lSe dizolvă 0,17 g nitrat de argint (3.9) în 10 ml apă.3.21. Faza mobila HPLCSe amestecă 500 ml acetonitril (3.1) cu 300 ml soluţie tampon acetat de amoniu (3.18) şi 1200 ml apă (3.14), pH-ul se ajustează la 4,3 utilizându-se acid acetic (3.5). Se filtrează prin filtru de 0,22 mm (4.8) şi se degazează soluţia (ex. prin ultrasunete timp de 10 minute). Această soluţie este stabilă timp de o luna, dacă este păstrată la întuneric într-un recipient închis.4. Aparatura4.1. Baie de ultrasunete4.2. Evaporator cu film rotativ4.3. Centrifugă4.4. Echipament HPLC cu detector UV cu lungimi de unda variabile sau detector cu sistem de diode în linie.4.4.1. Coloana de cromatografie lichidă: 300 mm x 4 mm, C 18, 10 mm sau o coloana echivalenta.4.5. Coloana de sticlă (300 mm x 10 mm) prevăzută cu filtru din sticla sinterizata şi robinet.4.6. Filtre din fibre de sticlă, diametru 150 mm4.7. Filtru cu membrana de 0,45 mm4.8. Filtru cu membrana de 0,22 mm5. Metoda de lucruNotă: Halofuginona ca bază liberă este instabilă în soluţii alcaline şi de acetat de etil. Aceasta nu trebuie să rămână în acetat de etil mai mult de 30 minute.5.1. Generalităţi5.1.1. Trebuie analizat un furaj martor pentru a se verifica absenţa halofuginonei şi interferenta substanţelor.5.1.2. Trebuie efectuat un test de randament prin care se analizează un furaj martor ce a fost îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de halofuginonă identică cu cea prezentă în probă. Pentru a se îmbogăţi la un nivel de 3 mg/kg, se adaugă 300 ml soluţie standard (etalon) stoc (3.6.1) la 10 g din furajul martor, se amestecă şi se aşteaptă timp de 10 minute înainte de procedura de extracţie (5.2).Notă: În cadrul acestei metode, furajul martor trebuie să fie similar, ca tip, cu cel al probei de cercetat, iar cu privire la analiză, nu trebuie să fie detectată halofuginona.5.2. ExtracţieSe cântăresc, cu o precizie de 0,1 g, 10 g din proba preparată într-un tub de centrifugă de 200 ml, se adaugă 0,5 g ascorbat de sodiu (3.10), 0,5 ml EDTA (3.13) şi 20 ml apă şi se amestecă. Se transferă într-un pahar conic de 250 ml şi se adaugă 100,0 ml metanol acidifiat (3.2). Se introduce tubul timp de 5 minute într-o baie de apă (80°C). După răcire la temperatura camerei, se adaugă 20 ml soluţie carbonat de sodiu (3.15) şi se amestecă. Imediat se adaugă 100 ml acetat de etil (3.4) şi se agită energic timp de 15 secunde. Apoi se introduce tubul timp de trei minute în baia de ultrasunete (4.1) şi se desface dopul. Se centrifughează timp de 2 minute şi se decantează faza de acetat de etil prin filtrul din fibra de sticla (4.6), într-o pâlnie de separare de 500 ml. Se repeta extracţia probei cu a doua parte de 100 ml de acetat de etil. Se spală extractele combinate timp de un minut cu 50 ml soluţie de carbonat de sodiu saturata în clorura de sodiu (3.16) şi se înlătură faza apoasă.Se extrage faza organică timp de 1 minut cu 5 ml acid clorhidric (3.17). Se transferă faza acidă inferioară într-o pâlnie de separare de 250 ml. Se extrage din nou faza organică timp de 1,5 minute cu o altă parte de 50 ml acid clorhidric şi se combina cu primul extract. Se spală extractele acide combinate prin agitare timp de aproximativ 10 secunde cu 10 ml acetat de etil (3.4).Se transferă cantitativ faza apoasă într-un balon cu fund rotund de 250 ml şi se elimina faza organică. Se evaporă tot restul de acetat de etil din soluţia acidă utilizând un evaporator cu film rotativ (2.4) temperatura băii de apă nu trebuie să depăşească 40°C. Sub un vid de aproximativ 25 mbar toate reziduurile de acetat de etil trebuie să se elimine în 5 minute, la 38°C.5.3. Purificarea5.3.1. Prepararea coloanei de AmberlitePentru fiecare extract de proba se prepara o coloana XAD-2. (3.8). Se transferă 10 g de Amberlite preparat într-o coloana de sticla cu metanol (4.5). Se adaugă un mic tampon de vata de sticla deasupra stratului de rasina. Se scurge metanolul din coloana cu metanol şi se spală rasina cu 100 ml apă, oprind scurgerea în momentul în care lichidul ajunge la suprafaţa stratului de rasina. Coloana se lasă să se stabilizeze timp de 10 minute înainte de utilizare. Niciodată nu se lasă coloana să se usuce.5.3.2. Purificarea probeiExtractul se transferă (5.2) la suprafaţa coloanei de Amberlite preparata (5.3.1) şi se eluează, îndepărtând eluantul. Viteza de eluţie nu trebuie să depăşească 20 ml/minut. Se clăteşte balonul cu fund rotund cu 20 ml acid clorhidric (3.17) şi se utilizează această soluţie la spălarea coloanei răşinii. Se suflă asupra soluţiei de acid ce a rămas cu un curent de aer. Se îndepărtează lichidele de spălare. Se adaugă 100 ml metanol (3.8), în coloană şi se lasă să elueze 5-10 ml colectând eluantul într-un balon cu fund rotund de 250 ml. Metanolul rămas se lasă timp de zece minute să se stabilizeze cu răşina şi se continuă eluţia la o viteză ce nu depăşeşte 20 ml/minut, colectând eluantul în acelaşi balon cu fund rotund. Se evaporă metanolul cu ajutorul evaporatorului cu film rotativ (4.2), temperatura băii de apă nu trebuie să depăşească 40°C. Se transferă cantitativ reziduul într-un balon cotat de 10 ml utilizând faza mobilă (3.21). Se aduce la semn cu faza mobilă şi se amestecă. O parte alicota este filtrată prin membrana filtrului (4.7). Această soluţie se stochează pentru determinare HPLC (5.4).5.4. Determinare HPLC5.4.1. ParametriUrmătoarele condiţii sunt oferite pentru orientare, putând fi utilizate, cu condiţia să ofere rezultate echivalente:Coloana de cromatografie lichidă (4.4.1), faza mobila HPLC (3.21),Debit: 1,5-2 ml/minut,Lungime de unda: 243 nm,Volum injectat: 40-100 ml.Se verifică stabilitatea sistemului cromatografic, se injectează soluţia de etalonare (3.9.3) ce conţine 3,0 mg/ml, de câte ori este nevoie, până când sunt obţinute înălţimi sau arii ale picului şi timpi de retenţie constanţi.5.4.2. Curba de etalonareSe injectează fiecare soluţie de etalonare (3.6.2.) de câte ori este nevoie şi se măsoară înălţimile picurilor (ariilor) pentru fiecare concentraţie. Se reprezintă grafic o curba de etalonare utilizând mediile picurilor sau ariilor principale ale soluţiilor de etalonare ca ordonate şi concentraţiile corespunzătoare în mg/ml ca abscise.5.4.3. Soluţia probeiSe injectează extractul probei (5.3.2) de câte ori este necesar, utilizând aceleaşi volume luate drept soluţii de etalonare şi se determina înălţimea (aria) medie a picului de halofuginonă.6. Calcularea rezultatelorSe determină concentraţia probelor în mg/ml din media înălţimilor (ariilor) picurilor de halofuginonă a probelor, prin referire la curba de etalonare (5.4.2).Conţinutul probei în halofuginonă w (mg/ml) este dat de următoarea formulă: c x 10 w = –– mîn care:c = concentraţia probei în halofuginonă, în mg/ml,m = masa probei exprimată în g7. Validarea rezultatelor7.1. IdentitateIdentitatea produsului analizat poate fi confirmată prin cromatografie sau prin utilizarea unui detector cu sistem de diode, prin care sunt comparate spectrul extractului probei şi al soluţiei de calibrare (3.6.2) ce conţine 6 mg/ml.7.1.1. Co-cromatografiaUn extract al probei este îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi corespunzătoare din soluţia etalon (3.9.3). Cantitatea de halofuginonă adăugată trebuie să fie similară cantităţii estimate de halofuginonă detectată în extractul probei.Numai înălţimea picurilor de halofuginonă trebuie să crească după luarea în calcul a ambelor cantităţi adăugate şi diluarea extractului. Lărgimea picului, la jumătate din înălţimea maxima, trebuie să se încadreze în maxim ±10% din lărgimea iniţială.7.1.2. Detectarea prin sistemul de diodeRezultatele sunt evaluate în conformitate cu următoarele criterii:a) lungimea de undă a absorbţiei maxime a probei şi a spectrelor standard, înregistrate pe cromatogramă la vârful picului, trebuie să fie aceeaşi cu o limita de siguranţă determinata prin puterea de rezoluţie a sistemului de detectare. Pentru detectare prin sistemul de diode, aceasta este tipică în cadrul a ±2 nm. … b) între 225 şi 300 nm, spectrul standard şi al probei, înregistrate pe cromatogramă, la vârful picului, nu trebuie să fie diferite pentru acele părţi ale spectrului cuprinse între 10 şi 100% ale absorbţiei relative. Acest criteriu este îndeplinit când sunt prezente aceleaşi maxime şi când la nici un punct observat deviaţia între cele doua spectre nu depăşeşte 15% din absorbţia probei de analizat standard. … c) între 225 şi 300 nm, spectrul curbei ascendente, al vârfului şi al curbei descendente a picului, produse de extractul probei nu trebuie să fie diferit unul de celălalt pentru acele părţi ale spectrului în interiorul gamei de la 10 la 100% de absorbţie relativă. Acest criteriu este îndeplinit când sunt prezente aceleaşi maxime şi când la toate punctele observate deviaţia între spectre nu depăşeşte 15% din absorbţia spectrului vârfului. Dacă unul din aceste criterii nu este îndeplinit, prezenta substanţei de analizat nu este confirmată. … 7.2. RepetabilitateDiferenţa între rezultatele a 2 determinări paralele, efectuate pe aceeaşi proba, nu trebuie să depăşească 0,5 mg/kg pentru un conţinut în halofuginonă, până la 3 mg/kg.7.3. RandamentPentru proba martor îmbogăţită, randamentul trebuie să fie de minim 80%.8. Rezultatele unui studiu de colaborareA fost organizat un studiu de colaborare(1) în care trei probe au fost analizate în opt laboratoare.Rezultate┌───────────────────┬────────────┬──────────────────────┬──────────────────────┐│ │ Proba A │ Proba B (Făina) │ Proba C (Pelete) ││ │ (Martor) ├──────────┬───────────┼──────────┬───────────┤│ │ la primire │la primire│după 2 luni│la primire│după 2 luni│├───────────────────┼────────────┼──────────┼───────────┼──────────┼───────────┤│ Media(1) │ n.d. │ 2,80 │ 2,42 │ 2,89 │ 2,45 │├───────────────────┼────────────┼──────────┼───────────┼──────────┼───────────┤│ Sr │ – │ 0,45 │ 0,43 │ 0,40 │ 0,42 │├───────────────────┼────────────┼──────────┼───────────┼──────────┼───────────┤│ CV(R) │ – │ 16 │ 18 │ 14 │ 17 │├───────────────────┼────────────┼──────────┼───────────┼──────────┼───────────┤│ rec. │ │ 86 │ 74 │ 88 │ 75 │└───────────────────┴────────────┴──────────┴───────────┴──────────┴───────────┘ (1) unităţi: în mg/kg n.d.: nedetectată SR: deviaţia standard a reproductibilităţii CV(R): coeficient de variaţie (%) rec.: randament (%)––––
