Vă rugăm să vă conectați la marcaj

Informatii Document

Emitent: AGENTIA VETERINARA SI PENTRU SIGURANTA ALIMENTELOR
Publicat în: MONITORUL OFICIAL nr. 1.020 bis din 4 noiembrie 2004

Actiuni Suferite

Actiuni Induse

Refera pe

Referit de

Actiuni suferite de acest act:

SECTIUNE ACT	TIP OPERATIUNE	ACT NORMATIV
Actul	ABROGAT DE	ORDIN 46 26/02/2007

Nu exista actiuni induse de acest act

Acte referite de acest act:

SECTIUNE ACT	REFERA PE	ACT NORMATIV
Actul	ARE LEGATURA CU	ORDIN 14 10/06/2004

Acte care fac referire la acest act:

SECTIUNE ACT	REFERIT DE	ACT NORMATIV
Actul	ABROGAT DE	ORDIN 46 26/02/2007
Actul	REFERIT DE	ORDIN 21 01/02/2007
Actul	APROBAT DE	ORDIN 14 10/06/2004
Actul	CONTINUT DE	ORDIN 14 10/06/2004

privind metode naţionale de analiza pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conţinutul în aflatoxina*)

Notă …
*) Aprobata prin Ordinul nr. 14 din 10 iunie 2004, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1020 din 4 noiembrie 2004.

ANEXĂ

NORMĂ VETERINARĂ

privind metode naționale de analiză

pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conținutul în aflatoxină

ANEXĂ

la norma veterinară

3.2 Cloroform, stabilizat cu o.s până la 1.o% de 96% etanol (v/v).

3.3. 1I-hexane.
3.4. Metanol
3.5. Eter etilic anhidru, liber de peroxid
3.6. Amestec de benzen şi acetonitril: 98/2 (v/v).
3.7. Amesteic de cloroform (3.2) şi metanol (3.4): 97/3 (v/v)

3.8 Silicagel, pentru coloana cromatografică, măsura particulei o–os până la 0-20 mm.

3.9. Vată de bumbac absorbantă, degresată anterior cu cloroform, sau vat i de sticlă,

3.1O. Sulfat de sodiu, anhidru, granular

3.11. Gaz inert, de ex. nitrogen

3.12 Acid clorhidric 1 N

3.13. acid sulfuric 50% ( v/v)
3.14. Diaton1it (hyflosupercel), spălat în acid.
3.15. Silicagel G-HH sau echivalent, pentru CSS
3.16. Soluţie standard cu aproximativ o.1 µg de aflatoxină 81 per ml în cloroforrn ( 3.2) sau amestHc de benzen/acetonitril (3.6)1preparat şi verificat aşa cum s-a indicat la Secţiunea 7.
3.17. Soluţie standard pentru scopuri de testare calitativă ce conţine aproximativ 0–1 µg de aflatoxină B·1 şi 82 per ml în cloroform (3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6). Aceste concentraţii sunt prezentate ca un ghid. Acestea trebuie să fie ajustate astfel încf:1t să se obţină aceeaşi intensitate de fluorescenţă pentru ambele aflatoxine.
3.18. Solvenţi de developare:
1. 3.18.1. Cloroform (3.2)/acetonă (:3.1) : 9/1 (v/v), soluţie mamă nesaturată·I
2. 3.18.2. Eter etilic (3.5)/metanol (:3.4)/apă : 96/3/1 (v/v/v, soluţie mamă nesaturată);
3. 3.18.3. Eter etilic (3.5)/metanol (3.4)/apă : 94/4.5/1.5 (v/v/v), soluţie man1ă nesaturată;

3.18.4 Cloroform (3,.2)/metanol (3.4) : 94/6 (v/v), soluţie mamă saturată;

3.18.5. Cloroform (3.2)/metanol (3.4) : 97/3 (v/v), soluţie mamă saturată;

4. Aparatură.
1. 4.1. Râşniţăt …rnixer
2. 4.2. Se scutură1 aparatul sau se agită ,nagnetic
3. 4.3. Hârtie de filtru canelată, Schleicher şi SchOII nr 588 sau echivalent, diametru : 24 cm
  
  4.4 Tub de sticlă pentru cromatografie (diametru intern : 22 mmj lungime : 300 mm), cu un robinet PTFE şi un rezervor de 250 ml.
  aflatoxină 81 să fie distins cu claritate pe o placă CSS la o distanţă de 1O cm de lampă.
  
  4.1O. Tuburi gradate de 1O ml cu dopuri de polietilenă.
5. Procedură.
1. 5.1. Prepararea probei (vezi ăObservaţii”, Partea C, punctul
  
  1).
  
  Se râşneşte proba astfel încât întreaga cantitate să treacă
  
  printr-o sită cu ochiuri de 1 mm (în concordanţă cu recomandarea ISO R 565).
2. 5.2. Extractie
  
  '
  
  Se pun 50 g de probă râşnită, omogenizată într-un tub conic
  
  de 500 ml. Se adaugă 25 g de diatomit (3.14), 25 ml de apă şi 250 ml de cloroform (3.2). Se astupă balonul, se scutură sau se agită pentru 30 de minute cu aparatul (4.2) şi se filtrează printr o hârtie de filtru canelată (4.3). Se înlătură primii 1O ml din filtrat şi apoi se colectează 50 ml.
3. 5.3. Curătarea coloanei
  
  '
  
  Se insereaza în capătul inferior al unui tub de cromatografie
  
  (4.4) un dop de vată de bumbac sau de sticlă (3.9), se umple două treimi din tub cu cloroform (3.2) şi se adaugă 5 g de sulfat de sodiu (3.1O).
  
  Se verifică dacă suprafaţa superioară a stratului de sulfat de sodiu este netedă, apoi se adaugă 1O g de silicagel (3.8) în porţiuni mici. Se agită cu atenţie după fiecare adiţie, pentru a elimina bulele de aer. Se lasă în repaos timp de 15.minute şi apoi se adaugă cu atenţie 15 g de sulfat de sodiu (3.1O). Se lasă lichidul să cadă până când acesta este tocmai deasupra suprafeţei superioare a stratului de sulfat de sodiu.
  
  Se amestecă 50 ml de extract colectat la 5.2 cu 100 ml de n-hexan (3.3) şi se transferă cantitatea din amestecul coloanei. Se lasă lichidul să cadă până când acesta este tocmai
  
  deasupra suprafeţei superioare a stratului de sulfat de sodiu. Se elimină această spălare.
  
  Apoi se adaugă 100 ml de eter etilic (3.5) şi se lasă din nou să cadă până la suprafaţa superioară a stratului de sulfat de sodiu. în timpul acestor operaţiunii se observă că debitul este 8 până la 12 ml per minut şi coloana nu devine uscată. Se elimină lichidul care iese. Se eluează apoi cu 150 ml de amestec de cloroform/metanol (3.7) şi se colectează întregul eluat.
  
  Se evaporă cel din urmă până aproape de uscare la o temperatură ce nu depăşeşte 50 °C şi sub un jet de gaz inert (3.11) cu evaporator rotativ (4.5). Se transferă în mod cantitativ reziduul, utilizând cloroform (3.2) sau amestec de benzen – acetonitril (3.6), într-un tub gradat de 1O ml {4._1O). Se concentrează soluţia sub un jet de gaz inert (3.11) şi apoi se ajustează volumul până la 2 ml cu cloroform (3 2) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6).
4. 5.4. Cromatografie în strat subţire
  
  Se efectuează un spot pe o placă pentru cromatografie în strat subţire (4.8), 2 cm de la marginea inferioară şi la distanţe de 2 cm, cu volume indicate mai jos din soluţia standard şi din extract:
  
  – 1O, 15, 20, 30 şi 40 µI din soluţia standard de aflatoxină
  
  81 (3.16);
  - – 1O µI din extractul obţinut la 5.3 şi, suprapus pe acelaşi punct,
  - – 20 µI de soluţie standard (3.16);
  - – 1O şi 20 µI de extras obţinut la 5. .
  Se developează cromatograma la întuneric cu unul din solvenţii de developare (3.18).
  
  Alegerea solventului trebuie să fie efectuată în prealabil, prin depozitare de 25 µI de soluţie standard calitativă (3.17}' pe placă şi verificând ca atunci când se developează, aflatoxinele 81 şi 82 sunt complet separate. ,
  
  Se lasă solvenţii să se evapore la întuneric şi apoi se iradiază cu lumină UV, plasând placa la 1O cm de lampă (4.9). Spoturile de aflatoxină 81 dau o fluorescenţă albastră.
5. 5.5. Determinări cantitative
  
  Se determină fie vizual, fie prin fluorodensitometrie, aşa cum s-a indicat mai jos.
  1. 5.5.1. Măsurări vizuale
    
    Se determină cantitatea de aflatoxină 81 din extract, prin compararea intensităţii fluorescenţei din spoturile de extract cu cea a unuia din spoturile soluţiei standard. Se interpolează dacă este necesar. Fluorescenţa obţinută prin suprapunerea extractului din solutia standard trebuie să fie mai intensă decât
    
    cea a cantităţii de 1'O µI de extract şi nu trebuie să fie mai mare
    
    decât un spot vizibil. Dacă intensitatea fluorescenţei dată de cantitatea de 1O µI de extras este mai mare decât cea de 40 µI din solutia standard, se diluează extractul de 1O sau 100 de ori
    
    cu cloro' form (3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6)
    
    înainte să fie supus din nou cromatografiei în strat subţire.
  2. 5.5.2. Măsurări prin fluorodensitometrie
    
    Se măsoară intensitatea fluorescenţei spoturilor de aflatoxină 81 cu fluorodensitometru (4.12) la o excitaţie a lungimii de undă de 365 nm şi o emisie a lungimii de undă de 443 nm. Se determină cantitatea de aflatoxină 81 din spoturile de extract, prin compararea intensităţilor fluorescenţei acestora cu cea a spoturilor de aflatoxină 81 standard.
6. 5.6. Confirmarea identitătii aflatoxinei 81
  
  '
  
  Confirmarea identitătii aflatoxinei 81 din extract se efectuează prin procesele 'indicate mai jos.
  1. 5.6.1. Tratare cu acid sulfuric
    
    Se pulverizează acid sulfuric (3.13) pe cromatograma obţinută la 5.4. Fluorescenţa spoturilor de aflatoxină 81 trebuie să devină, sub iradierea UV din albastră, galbenă.
  2. 5.6.2. Cromatografie bidimensională implicând formarea de aflatoxină 81-hemiacetat (aflatoxină 82a)
    
    N8: Operaţiunile descrise mai jos trebuie să fie efectuate urmând cu atenţie diagrama din figura 3. ·
    1. 5.6.2.1. Aplicarea soluţiilor
      
      Se trasează pe o placă (4.8) două linii drepte paralele la două părţi marginale (6 cm de fiecare parte) până la limita migraţiei fronturilor de solvent. Se marchează soluţiile următoare pe placă utilizându-se pipete capilare sau microseringi :
      - – în punctul A: un volum al probei de extract purificat, obţinută la 5.3, conţinând aproximativ 2. s ng de aflatoxină 81;
      - – în punctele 8 şi C: soluţie standard de 25 µI
    2. 5.6.2.2. Developare
      
      Se developează cromatograma în direcţia I, la întuneric, utilizând solvent de developare (3.18.1)(un strat de 1 cm dintr-o soluţie mamă nesaturată) până când frontul de solvent atinge linia limită a solventului. Se îndepărtează soluţia mamă de pe placă şi se lasă să se usuce la întuneric, la temperatura ambiantă, timp de cinci minute. Se pulverizează apoi cu acid clorhidric (3.12) de a lungul unei bande de 2. s cm înălţime ce acoperă punctele A şi 8 (indicată prin zona haşurată în figura 3.) până când se întunecă, protejând restul plăcii cu o foaie de sticlă. Se lasă să reacţioneze timp de 1O minute la întuneric şi se usucă cu un curent de aer la temperatură ambiantă. Se developează apoi cromatograma în direcţia li, la întuneric, utilizând solvent de developare (3.18.1) (un strat de 1 cm dintr-o soluţie mamă nesaturată) până când frontul de solvent ajunge la linia limită a solventului. Se îndepărtează soluţia mamă de pe placă şi se lasă să se usuce la temperatura ambiantă.
    3. 5.6.2.3. Interpretarea cromatogramei.

Se examinează cromatograma sub lumină UV (4.9) şi se verifică următoarele caracteristici

(a) Apariţia unui spot albastru de aflatoxină 81 ce provine de la soluţia standard aplicată în punctul C (migrare în direcţia I).

AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR

O R D I N

pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește metode de analiză pentru controlul oficial

al furajelor privind umiditatea, bazele azotate volatile, fosforul total și uleiurile și grăsimile brute*)

În temeiul prevederilor art. 10 lit. b) din Ordonanța Guvernului nr. 42/2004 privind organizarea activității veterinare, în baza Hotărârii Guvernului nr. 308/2004 privind organizarea și funcționarea Agenției Veterinare și pentru

Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia,

văzând Referatul de aprobare nr. 153.452 din 28 mai 2004 al Direcției generale veterinare,

președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin:

Art. 1. — Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor privind umiditatea, bazele azotate volatile, fosforul total și uleiurile

și grăsimile brute, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art. 2. — Institutele centrale de profil, direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a

municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Art. 3. — Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin.

Art. 4. — Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor,

Liviu Harbuz

București, 10 iunie 2004.

Nr. 15.

*) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 15/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis.

**) Anexa este reprodusă în facsimil.

ANEXĂ

NORMĂ VETERINARĂ

ce stabilește metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor

privind umiditatea, bazele azotate volatile, fosforul total și uleiurile și grăsimile brute

ANEXĂ

la norma veterinară

3.3. Fiole uscate din metal necorosiv sau din sticlă cu capace ce asigură o închidere etanşă; suprafaţă de lucru ce permite ca proba test să fie difuzată la vreo 0,3g/cm2.
3.4. Etuva termoreglabila (±1°C), cu ventilatie şi care asigură reglarea rapidă a temperaturii C).
3.5. Etuva cu vacuum încălzita electric dotata cu o pompă de ulei sau un mecanism pentru introducerea de aer uscat fierbinte sau a unui agent de uscare (de ex. oxid de calciu).
3.6. Desicator cu placă confecţionată dintr-un metal perforat gol sau din porţelan ce conţine un agent de uscare eficient.

4. Procedură

N.B.: Operaţiunile descrise de această secţiune trebuie să fie efectuate imediat după deschiderea pachetelor de probe. Analiza trebuie să fie efectuată în cel puţin un duplicat.
1. 4.1. Preparare
  1. 4.1.1. Furaje, altele decât cele ce sunt sub incidenţa punctelor 4.1.2. şi 4.1.3. Se iau cel puţin 50 de grame din probă. Dacă este necesar, se macină şi se împarte în aşa fel, încât să de evite orice variaţie în conţinutul de umiditate(vezi 6).
  2. 4.1.2. Cereale şi ovăz
    
    Se iau cel puţin 50 de grame din probă. Se macină în particule din care cel puţin 50°/c, trec printr-o sită cu plasă de
    
    O,75mm şi nu se permite să fie retinute mai mult de 10% particule pe un ochi de plasă de 1mm2.
  3. 4.1.3. Furaje sub formă lichidă sau de pastă, furaje
    
    compuse predominant din uleiuri şi grăsimi.
    
    Se iau circa 25 de g din probă, se cântăresc cu o aproximaţie de 1O mg, se adaugă o cantitate corespunzătoare de nisip anhidros, cântărit cu o aproximaţie de 1O mg şi se amestecă până este obţinut un produs omogen.
    
    (1) Pentru uscarea cerealelor, a făinii, a ovăzului şi a crupelor de ovăz, etuva trebuie să aibă o astfel de capacitate termică, încât atunci când este pre-fixat la 131°C acesta să revină la acea temperatură în mai puţin de 45 de minute după numărul maxim de probe test ce au fost plasate simultan în interior să se usuce. Ventilatia trebuie să fie astfel ca, atunci când sunt mai multe probe de grâu obişnuit decât le poate conţine şi sunt uscate timp de două ore, rezultatele diferă de cele obţinute după patru ore de uscare cu mai puţin de 0,715%.
2. 4.2. Uscare
  1. 4.2.1. Furaje, altele decât cele ce sunt reglementate de
  2. 4.2.2. şi 4.2.3.
    
    Se cântăreşte o fiola (3.3) împreună cu capacul acestuia cu o aproximaţie de 0,5 mg. Se cântăresc în fiola cântărita cu o aproximaţie de 1 mg, aproximativ 5 g din probă şi chiar se difuzează. Se plasează containerul, fără capacul acestuia, în etuva preîncălzita la 103°C. Se introduce fiola cât mai repede posibil, pentru a se preveni ca temperatura cuptorului să scadă nejustificat. Se lasă să se usuce timp de patru ore, calculate din momentul în care temperatura etuvei revine la 103°C. Se înlocuieşte capacul de pe fiola, se înlătură acesta din urmă de pe cuptor, se lasă să se răcească timp de 30-45 de minute în desicator(3.6) şi se cântăreşte cu o aproximaţie de 1 mg.
    
    Pentru furaje combinate compuse predominant din uleiuri şi grăsimi, se usucă în etuva timp de încă 30 de minute la 130°C. Diferenţa dintre două cântăriri nu trebuie să depăşească 0,1% umiditate.
    
    4.2.2. Cereale, făină, ovăz şi făină
    
    Se cântăreşte o fiola (3.3) împreună cu capacul acesteia, cu o aproximaţie de 0,75mg. Se cântăreşte în fiola cântărita cu o aproximaţie de 1mg, aproximativ 5g din proba măcinată şi chiar se difuzează. Se plasează fiola, fără capacul acesteia, în etuva preîncălzita la 130°C. Se introduce containerul cât mai repede posibil, pentru a se preveni ca temperatura cuptorului să scadă nejustificat. Se lasă să se usuce timp de patru ore calculate din momentul în care temperatura cuptorului revine la 103°C. Se înlocuieşte capacul de pe container, se înlătură acesta din urmă de pe cuptor, se lasă se răcească timp de 30- 45 de minute în desicator(3.6) şi se cântăreşte cu o marjă de 1mg.
    
    4.2.3. Furaje combinate ce conţin mai mult de 4% sucroză sau lactoză: furaje simple precum păstăi de fasole, produse cereale hidrolizate, seminţe de malţ, cartofi şi sfeclă uscată, peşte şi zahăr solubil; furaje combinate ce conţin mai mult de 25% săruri minerale, incluzând apă de cristalizare.
    
    Se cântăreşte o fiola (3.3) împreună cu capacul acestuia, cu o aproximaţie de 0,75mg. Se cântăresc în containerul cântărit cu o marjă de 1mg, aproximativ 5g din proba măcinată şi chiar se difuzează. Se plasează containerul, fără capacul acesteia, în etuva cu vacuum preîncălzit între 80-85°C. Se introduce fiola cât mai repede posibil, pentru a se preveni ca temperatura etuvei să scadă nejustificat.
    
    Se aduce presiunea până la 100 Torr şi se lasă să se usuce timp de patru ore la această temperatură, fie într-un curent de aer fierbinte, uscat fie utilizându-se un agent de uscare (aproximativ 300 g pentru 20 de probe). În ultimă instanţă, se deconectează pompa de vacuum, atunci când a fost atinsă presiunea prescrisă.
    
    Timpul de uscare se calculează din momentul când temperatura cuptorului revine la 80-85°C. Se aduce etuva cu grijă înapoi la presiunea atmosferică. Se deschide etuva, se plasează imediat capacul pe fiola, se îndepărtează fiola din etuva, se lasă să se răcească timp de 30-45 în desicator(3.6) şi se cântăreşte cu o aproximaţie de 1 mg. Se usucă timp de încă 30 de minute în etuva cu vacuum la 80-85°C şi se recântăreşte. Diferenţa dintre două cântăriri nu trebuie să depăşească 0,71°/o umiditate.
3. 4.3. Uscare preliminară
  1. 4.3.1. Furaje, altele decât cele ce sunt reglementate de 4.3.2.
    
    Furaje solide cu un conţinut ridicat de umiditate ce face ca măcinarea să fie supusă uscării preliminare după cum urmează: Se cântăresc 50g de probă nemăcinată cu o aproximaţie de 10mg (furajele comprimate şi aglomerate pot fi împărţite după duritate , dacă este necesar) într-un container potrivit (de ex. o placă de aluminiu de 20×12 cm cu o ramă de 0,75cm). Se lasă să se usuce într-o etuva de la 60-70°C până când conţinutul de umiditate s-a redus la 8-12%. Se îndepărtează din etuva, se lasă descoperit ca să se răcească în laborator pentru o oră şi se cântăreşte cu o aproximaţie de 1O mg. Se zdrobeşte imediat, aşa cum s-a indicat la punctul 4.1.1. şi se usucă aşa cum s-a indicat la punctul 4.2.1. sau 4.2.3., în conformitate cu natura furajului. ,
  2. 4.3.2. Cereale
    
    Boabele cu un conţinut de umiditate·de peste 17%, trebuie să fie supuse unei uscări preliminarii după cum urmează:
    
    Se cântăresc 50g de boabe neîncolţite, cu o aproximaţie de 10mg într-un container corespunzător (de ex. o placă de aluminiu de 20×12 cm cu o ramă de 0,5cm). Se lasă să se usuce timp de 5-7 minute într-o etuva, la 130°C. Se scoate din etuva, se lasă să se răcească descoperit în laborator, timp de două ore şi se cântăresc cu o aproximaţie de 1O mg. Se macină aşa cum s-a indicat la 4.1.2. şi se usucă, aşa cum s-a indicat la punctul 4.2.2.
5. Calcularea rezultatelor

Conţinutul de umiditate, ca procent din probă, este calculat utilizând următoarea formulă:
1. 5.1. Uscare fără uscare preliminară (E-m)x ioo
  
  E
  
  unde: E=masă iniţială a probei test, în grame, m=masa probei test uscate, în grame,
2. 5.2. Uscare cu uscare preliminară
  
  [(M'-m)M+E-M]xlOO=100(1– Mm) M' E EM'
  
  unde: E=masă iniţială a probei test, în grame,
  
  M= masa a probei test după uscare preliminară, în
  
  grame,
  
  M'= masa probei test după zdrobire, în grame, m=masa probei test uscate, în grame.
  
  5.3. Repetabilitate
  
  Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe aceeaşi probă nu trebuie să depăşească 0,2°/c, de umiditate.
6. Observatie

Dacă măcin' area se dovedeşte a fi necesară şi dacă

aceasta este estimată că alterează continutul în umiditate al produsului, rezultatele analizei componenţilor furajului trebuie să fie corectate pe baza conţinutului probei în starea iniţială a acesteia.

li. DETERMINAREA BAZELOR AZOTATE VOLATILE

A. MICRODIFUZIE
1. 1. Scop şi domeniu de aplicare
  
  Această metodă face posibil să se determine conţinutul de baze azotate în furaje, exprimate ca amoniac.
2. 2. Principiu
  
  Proba este extrasă cu apă şi soluţie clarificată şi filtrată. Bazele azotate volatile sunt dislocate prin micro-difuzie, utilizându-se o soluţie de carbonat de potasiu, colectată într-o soluţie de acid boric şi titrată cu acid sulfuric.
3. 3. Reactivi
  1. 3.1. 20% (w/v) soluţie de tricloracetic.
  2. 3.2. Indicator: se dizolvă 33 de mg de verde bromcrezol şi 65 de mg de roşu metil în 100ml de etanol 95-96%(v/v).
    
    '
  3. 3.3. Solutie de acid boric:
    
    '
    
    Într-un cilindru gradat de 1litru se dizolvă 1O g de acid boric A.R. în 200ml de etanol 95-96%(v/v) şi 700ml de apă. Se adaugă 1O ml de indicator(3.2.). Se amestecă şi dacă e necesar, se ajustează culoarea soluţiei spre roşu deschis, adăugând o soluţie de hidroxid de sodiu. 1 ml din această soluţie va fixa un maxim de 300 Dg de NH3.
  4. 3.4. Soluţie saturată de carbonat de potasiu:
    
    Se dizolvă 1OOg de carbonat de potasiu A.R. în 100 ml de apă fiartă. Se lasă să se răcească, se filtrează.
  5. 3.5. Acid sulfuric 0,02 N.
4. 4. Aparatură
  1. 4.1. Mixer (tip pahar): aproximativ 35-40 r.p.m.
  2. 4.2. Celule Conway de plastic sau de sticlă (vezi diagrama).
  3. 4.3. Microbiurete gradate în 1/100ml.
5. 5. Procedură
  
  Se cântăresc 1Og de probă, cu o aproximaţie de 1mg şi se plasează cu 100ml de apă într-un pahar gradat de 200 ml. Se amestecă în pahar timp de 30 de minute. Se adaugă 50 ml de soluţie de acid tricloracetic (3.1), se completează volumul cu apă, se agită cu vigoare şi se filtrează printr-un filtru plisat.
  
  Utilizând o pipetă, se introduce 1 ml de soluţie de acid boric(3.3) în partea centrală a celulei Conway şi 1 ml din filtratul probei în coroana celulei. Se acoperă parţial cu un capac lubrifiat. Se lasă să cadă rapid 1 ml de soluţie de carbonat de potasiu saturat (3.4) în coroană şi se închide capacul, astfel încât celula să nu primească aer. Se întoarce celula cu grijă, rotind-o în plan orizontal, astfel încât cei doi reactivi să fie amestecati.
  
  Se la' să incubat fie cel puţin patru ore la temperatura
  
  camerei fie pentru o oră la 40°C.
  
  Utilizând o microbiuretă(4.3), se titrează bazele volatile în soluţie de acid boric cu acid sulfuric 0,02N(3.5).
  
  Se efectuează un test steril, utilizând aceeaşi procedură, dar fără ca proba să fie analizată.
6. 6. Calcularea rezultatelor
  
  1ml de H2SO4 0,02N corespunde la 0,34 mg de amoniac. Se exprimă rezultatul ca procentaj al probei.
  
  Repetabilitate
  
  Diferenţa între rezultatele a două determinări paralele efectuate pe aceeaşi probă nu trebuie să depăşească:
  - – 10% în valoare relativă, pentru conţinut de amoniac mai puţin de 1,0%;
  - – O,1% în valoare absolută, pentru conţinut de amoniac de 1,0% sau mai mult.
7. 7. Observatie
  
  Se diluează' filtratul initial, dacă continutul de amoniac al
  
  probei depăşeşte 0,76%. ' '
B. PRIN DISTILARE
1. 1. Scopul şi domeniul de aplicare
  
  Această metodă face posibilă determinarea conţinutului de baze azotate volatile, exprimate ca amoniac, în faina de peşte ce nu conţine practic uree. Aceasta este aplicabilă numai pentru un conţinut de mai puţin de 0,25%.
2. 2. Principiu
  
  Proba este extrasă cu apă şi soluţie de clarificare. Bazele azotate volatile sunt dislocate la punctul de fierbere, adăugându-se oxid de magneziu şi colectate într-o cantitate
  
  specifică de acid sulfuric, al cărui exces este titrat apoi cu o solutie de hidroxid de sodiu.
  
  ' 3. Reactivi
  3.4 Acid sulfuric O,1N.
  
  l
3. 3. Reactivi
  1. 3.1. Carbonat de calciu p.a
  2. 3.2. Acid clorhidric p.a d:1,1 (aproximativ 6N).
  3. 3.3. Acid azotic p.a, d: 1,045.
  4. 3.4. Acid azotic p.a., d: 1,38-1,42.
  5. 3.5. Acid sulfuric p.a., d: 1,84.
  6. 3.6. Reactiv molibdovanadat:
    
    Se amestecă 200ml de soluţie de heptamolibdat de amoniu(3.6.1. ), 200ml de soluţie de monovanadat de amoniu(3.6.2) şi 134ml de acid azotic, într-un balon cotat de un litru. Se completează volumul cu apă distilata.
    1. 3.6.1. Soluţie de heptamolibdat de amoniu:
      
      Se dizolvă în apă distilata fierbinte 100g de heptamolibdat de amoniu p.a. (NH4)6Mo7O24_ 4H2O. Se adaugă 10ml de amoniac(d:0,91) şi se completează cu apă distilata până la un litru.
    2. 3.6.2. Solutie de monovanadat de amoniu:
      
      '
      
      2,735g de monovanadat de amoniu p.a. NH4VO3 se dizolvă în 400ml de apă distilata fierbinte·. Agitând constant, se adaugă lent 20ml de acid azotic p.a diluat (7ml de HNO3(3.4) + 13ml de H2O) şi se completează cu apă distilata până la un litru.
  7. 3.7. Soluţie standard de 1mg de fosfor per ml: se dizolvă 4,387g de fosfat dihidrogenat de potasiu p.a. KH2PO4 în apă. Se completează cu apă până la un litru.
4. 4. Aparatură
  1. 4.1. Creuzete pentru cenuşă din porţelan sau siliciu.
  2. 4.2. Cuptor electric cu termostat stabilit la 550°C.
  3. 4.3. Balon Kjeldahl de 250ml.
  4. 4.4. Baloane gradate şi pipete de precizie.
  5. 4.5. Spectrofotometru.
  6. 4.6. Eprubete gradate:25-30ml.
5. 5. Procedură
  
  –
  1. 5.1. Prepararea solutiei
    
    ln conformitate cu na'tura probei se prepară o soluţie aşa cum a indicat punctul 5.1.1 sau 5.1.2.
    1. 5.1.1. Procedura uzuală
      
      Se cântăreşte 1g sau mai mult din probă cu o aproximaţie de 1mg. Se plasează proba test într-un balon Kjeldahl, se adaugă 20ml de acid sulfuric (3.5), se agită pentru a impregna substanţa complet cu acid şi pentru a se preveni ca aceasta să nu se lipească de pereţii balonului, se încălzeşte şi se păstrează la punctul de fierbere timp de 1O minute. Se lasă să se răcească puţin, se adaugă puţin acid azotic (3.4) şi se aduce apoi la punctul de fierbere. Se repetă această procedură până când este obţinută o soluţie incoloră. Se răceşte, se adaugă puţină apă, se decantează lichidul într-un balon cotat de 500 de ml, clătind cu apă fierbinte balonul Kjeldahl. Se lasă să se răcească, se completează volumul cu apă, se omogenizează şi se filtrează.
    2. 5.1.2. Probe ce conţin substanţe organice şi libere de calciu şi fosfaţi de magneziu
      
      Se cântăresc aproximativ 2,5 g din probă, cu o aproximaţie de 1mg într-un creuzet de calcinare. Se amestecă proba test până când se omogenizeaza complet cu 1g de carbonat de
      
      calciu(3.1). Se calcinează în cuptor la 550°C+5°C până când este obţinută o cenuşă albă sau gri (nu contează puţin mangal). Se transferă cenuşa într-o capsula de portelan de 250ml. Se adaugă 20ml de apă şi acid clorhidric(3.2) până încetează efervescenţa. Se adaugă încă 10ml de acid clorhidric (3.2). Se plasează capsula de portelan pe o baie de nisip şi se evaporă până se usucă pentru a face silicatul insolubil. Se redizolvă reziduul în 10ml de acid azotic(3.3) şi se fierbe pe baia de nisip timp de 5 minute, fără să se evaporeze, până se usucă. Se decantează lichidul într-un balon cotat de 500ml, clătind capsula de portelan de câteva ori cu apă fierbinte. Se lasă să se răcească, se completează volumul cu apă, se omogenizează şi se filtrează.
  2. 5.2. Dezvoltarea coloraţiei şi măsurarea densităţii optice Se diluează o parte a picăturii filtrate obţinută la 5.1.1. sau
    
    5.1.2., pentru a obţine o concentraţie în fosfor de cel mult 40µg/ml. Se plasează 10ml din această soluţie într-o eprubetă(4.6) şi se adaugă 10ml de reactiv molibdovanadat(3.6). Se omogenizează şi se lasă să stea cel puţin 1O minute, la 20°C. Se măsoară densitatea optică într-un spectrometru la lungimea de undă de 430nm fata de o soluţie obţinuta prin adăugare de 10ml de reactiv molibdovanadat (3.6) în 10ml de apă.
  3. 5.3. Curba de calibrare
    
    Din soluţia standard(3.7.) se prepară soluţii ce conţin respectiv 5,10,20,30 şi 40 µg de fosfor per ml. Se iau 10ml din fiecare din aceste soluţii şi se adaugă 10ml de reactiv molibdovanadat (3.6). Se omogenizează şi se lasă să stea cel puţin 1O minute la 20°c. Se măsoară densitatea optică , aşa cum a indicat punctul 5.2.
    
    Se trasează curba de calibrare prin împărţirea densităţilor optice faţă de cantităţile corespunzătoare de fosfor. Curba va fi
    
    liniară pentru concentraţii între O şi 40 µg/ml.
6. 6. Calcularea rezultatelor
  
  Se determină cantitatea de fosfor din proba test pnn utilizarea curbei de calibrare.
  
  Se exprimă rezultatul ca procent din probă.
  
  Repetabilitate
  
  Diferenţa între rezultatele a două determinări paralele efectuate pe aceeaşi probă nu trebuie să depăşească:
  
  3% în valoare relativă, pentru conţinut de fosfor de mai puţin de 5%;
  
  O,15% în valoare absolută, pentru conţinut de fosfor de 5% sau mai mult.
  
  IV. DETERMINARE DE ULEIURI ŞI GRĂSIMI BRUTE
  1. 1. Scop şi domeniu de aplicare
    
    Această metodă este utilizată pentru determinarea uleiurilor şi grăsimilor brute din furaje. Aceasta nu se referă la analiza seminţelor uleioase şi a fructelor oleaginoase definite de legislaţia comunitară specifică.
    
    Utilizarea celor două proceduri descrise mai jos depinde de natura şi compoziţia furajului şi motivul pentru efectuarea analizei.
    1. 1.1. Procedura A – Uleiuri şi grăsimi brute direct
      
      extractibile
      
      Această metodă este aplicabilă materiilor furajere din plante, cu excepţia celor incluse în scopul Procedurii B.
    2. 1.2. Procedura B – Uleiuri şi grăsimi brute totale
      
      Această procedură este aplicabilă materiilor furajere de origine animală şi tuturor furajelor combinate. Aceasta trebuie să fie utilizată pentru toate materiile din care grăsimile şi uleiurile nu pot fi extrase complet fără o hidroliză anterioară (ex. gluten, drojdie, proteine din cartofi şi produse supuse proceselor precum extrudarea, floconarea şi încălzirea).
    3. 1.3. Interpretarea rezultatelor
      
      În toate cazurile în care este obtinut un rezultat mai ridicat prin utilizarea Procedurii B, decât pr'in Procedura A, rezultatul
      
      obţinut prin Procedura B va fi acceptat ca valoare adevărată.
  2. 2. Principiu
    Proba este tratată la cald cu acid clorhidric. Amestecul este răcit şi filtrat. Reziduul este spălat, uscat şi supus determinării, în conformitate cu Procedura A.
  3. 3. Reactivi
    1. 3.1. Eter etilic, punct de fierbere: 40-60°C. Valoarea de bromin trebuie să fie mai puţin de 1, iar reziduul din evaporare mai puţin de 2mg/100ml.
    2. 3.2. Sulfat de sodiu, anhidru
    3. 3.3. Acid clorhidric, c=3moli HCI/I
    4. 3.4. Cu ajutorul filtrării, Kieselguhr, supercelula Hyflo.
  4. 4. Aparatură
    1. 4.1. Aparatură de extracţie. Dacă a fost dotată cu un sifon (aparat Soxhlet), rata refluxului trebuie să fie astfel încât să producă aproximativ 10cicluri/oră; dacă este utilizat tipul non sifon, rata refluxului trebuie să fie de aproximativ 10ml per minut.
    2. 4.2. Canule de extractie, libere de materie solubilă în eter
      
      etilic şi care să aibă o po' rozitate în conformitate cu cerinţele punctului 4.1.
    3. 4.3. Etuva de uscare, fie o etuva cu vacuum fixat la 75°C+3°C fie o etuva cu aer fixat la 1oo°C+3°C.
  5. 5. Procedură
    1. 5.1. Procedura A(vezi punctul 8.1)
      
      Se cântăresc 5g din probă, cu o aproximaţie de 1mg, acestea se transferă într-un cartuş de extracţie(4.2) şi se acoperă cu un tampon de vată degresat.
      
      Se plasează un cartuş într-un extractor(4.1) şi se extrage timp de şase ore cu eter etilic(3.1). Se colectează extractul din eter etilic într-o retortă uscată, cântărită ce conţine fragmente de piatră ponce (1).
      
      Se distila solventul. Se usucă reziduul, menţinând retorta timp de o oră şi jumătate în etuva de uscare(4.3). Se lasă să se răcească într-un desicator şi se cântăreşte. Se usucă din nou timp de 30 de minute pentru a se asigura că greutatea uleiurilor şi grăsimilor rămâne constantă (pierderea în greutate între două cântăriri succesive trebuie să fie de mai puţin de 1 mg).
    2. 5.2. Procedura B
      
      AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR
      
      O R D I N
      
      pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conținutul în zinc-bacitracină, flavofosfolipol, fier,
      
      cupru, mangan și zinc*)
      
      În temeiul prevederilor art. 10 lit. b) din Ordonanța Guvernului nr. 42/2004 privind organizarea activității veterinare, în baza Hotărârii Guvernului nr. 308/2004 privind organizarea și funcționarea Agenției Veterinare și pentru
      
      Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia,
      
      văzând Referatul de aprobare nr. 153.355 din 27 mai 2004 al Direcției generale veterinare,
      
      președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin:
      
      Art. 1. — Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conținutul în zinc-bacitracină, flavofosfolipol, fier, cupru, mangan și zinc, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin.
      
      Art. 2. — Institutele centrale de profil, direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a
      
      municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.
      
      Art. 3. — Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin.
      
      Art. 4. — Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.
      
      Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor,
      
      Liviu Harbuz
      
      București, 10 iunie 2004.
      
      Nr. 16.
      
      *) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 16/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis.
      
      **) Anexa este reprodusă în facsimil.
      
      ANEXĂ
      
      NORMĂ VETERINARĂ
      
      ce stabilește metode naționale de analiză
      
      pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conținutul în zinc-bacitracină, flavofosfolipol, fier, cupru, mangan și zinc
      
      ANEXĂ
      
      la norma veterinară
      
      suspensia la diluţia 1/1O cu soluţie de clorură de sodiu (4.3). Transmisia luminoasă a suspensiei trebuie să fie de aproximativ 75%, măsurată la o lungime de undă de 650 nm într-un cm de celulă faţă de soluţia de clorură de sodiu (4.3). Această suspensie poate fi menţinută pentru o săptămână la cca. 4 QC
      1. 4. Mediu de cultură şi reactanţi
        
        4.1. mediu de cultură (b) Carne peptonată 6,0 g
        
        Triptone 4,0 g
        
        Extract de drojdie Extract de carne Glucoză
        
        Agar Apă
        
        3,0 g
        
        1,5 g
        
        1,0 g
        
        10,0 la 20,0 g
        
        1 OOO ml
        
        ph 6,5 la 6,6 (după sterilizare)
        
        4.2. Mediu de probă (b) Triptone 10,0 g Extract de drojdie 3,0 g
        
        Extract de carne Glucoză
        
        Agar Tween 80 Apă
        
        1,5 g
        
        1,0 g
        
        10,0 la 20,0 g
        
        1 ml
        
        1 OOO ml
        
        pH 6,5 (după sterilizare)
        
        4.3. Soluţie de clorură de sodiu 0,8% (w/v): se dizolvă 8 g clorură de sodiu în apă şi se diluează până la 1OOO ml; se steriIizează.
        
        4.4. Amestec de metanol/apă şI acid clorhidric (4.6): 80/17,5/2,5 (v/v/v)
        
        4.5. Tampon fosfatc, pH 6,5:
        
        Fosfat hidrogenat de potasiu K2HPO4 22,15 g Fosfat dihidrogenat de potasiu KH2PO4 27,85 g. Apă până la 1 OOO ml
        
        4.6. Acid clorhidric (d: 1,18 la 1,19).
        
        4.7 Acid clorhidric (O,1 M).
        
        4.8. Hidroxid de sodiu solutie 1 M.
        
        '
        
        4.9. Sulfit de sodiu solutie cca. 0,5 M
        
        '
        
        4.1O. Soluţie roşu de bromcrezol 0,04 % (w/v): se dizolvă
        
        O,1 g de roşu de bromcrezol în 18,5 ml din soluţia de hidroxid de sodiu 0,01 M. Se aduce volumul la 250 ml cu apă şi se amestecă.
        
        4.11. Substantă standard: zinc-bacitracină de activitate
        
        cunoscută (în u. i.). '
      2. 5. Solutii standard
        
        '
        
        Se cântăreşte o cantitate de zinc-bacitracină standard
        
        (4.11) ce corespunde la 1050 u.i (conform activităţii indicate). Se adaugă 5 ml de acid clorhidric 0,1 M (4.7) şi se lasă 15 minute. Se adaugă 30 ml de apă, se ajustează pH-ul la 4,5 cu tampon fosfat (4.5) (cca. 4 ml}, se aduce la un volum de 50 ml cu apă şi se amestecă bine (1 ml = 21 u.i.).
        
        Din această soluţie se prepară, prin diluţie succesivă cu tampon fosfat (4.5), următoarele soluţii:
        
        sa O, 42 u.i./ml S4 0,221 u.i./ml s2 O,105 u.i./ml s1 0,0525 u.i./ml
      3. 6. Prepararea soluţiilor de extract şi de probă
      Se cântăreşte o cantitate de probă de 2,0 până la 5,0 g, se adaugă 29,0 ml de amestec (4.4) şi 1,0 ml de soluţie de sulfit de
      
      sodiu (4.9) şi se agită uşor. Se verifică dacă pH-ul este cca. 2. Se agită 1O minute şi se centrifughează. Se prelevează o picătură corespunzătoare din soluţia de supernatant şi se ajustează pH-ul la 6,5 prin intermediul unei soluţii de hidroxid 1 M (4.8) cu un pH-metru sau cu soluţie roşu de bromcrezol (4.1O) ca indicator. Se diluează cu tampon fosfat (4.5) se obţine un conţinut dorit de zinc-bacitracină de 0,42 u.i./ml (=u8)
      Se cântăreşte o cantitate de probă de 10,0 g (20,0 g pentru un conţinut dorit de zinc-bacitracină de 5 mg/kg). Se adaugă un amestec de 24,0 ml de amestec (4.4) şi 1,0 ml de soluţie de sulfit de sodiu (4.9) şi se omogenizează timp de 1O minute. Se adaugă 25 ml tampon fosfat (4,5), se agită timp de
      
      15 minute şi se centrifughează. Se iau 20 ml de soluţie de supernatant şi se ajustează pH-ul până la 6.5 prin intermediul soluţiei de hidroxid de sodiu – 1 M (4.8) cu un pH-metru sau cu soluţie roşu de bromcrezol (4.1O) ca indicator. Se evaporă până la 4 ml într-un evaporator rotund, la o temperatură ce nu depăşeşte 35 °C. Se diluează reziduul cu tampon fosfat (4.5) până se obţine un conţinut dorit de zinc-bacitracină de 0,42 u i../ml (= u8).
      
      6.2. Soluţii probă
      
      Din soluţia u8 se prepară soluţii u4 (conţinut aşteptat: 0,21u i./ml), u2 (conţinut aşteptat: O,105 u.i./ml) şi u1 (conţinut aşteptat: 0,0525 u.i./ml) prin intermediul diluţiei succesive (1-1) cu tampon fosfat (4.5).
7. 7. Procedura de testare
  1. 7.1. Însământarea mediului de testare
    
    '
    
    Se însămânţează mediul de testare (4.2) cu o suspensie bacteriană (3.2) la aproximativ 50 °e. Prin experimentări preliminare pe plăci cu mediu de testare (4.2) se determină
    
    cantitatea de suspensie bacteriană necesară pentru a determina cele mai mari şi mai curate zone de inhibiţie cu diferite concentratii de zinc-bacitracină.
    
    '
  2. 7.2. Prepararea plăcilor de însămânţare
    
    Difuziunea pe agar este efectuată în plăci utilizându-se patru concentraţii din soluţia standard (s8,s4,s2,Şi s1) şi patru concentraţii din soluţia de testare (u8, u4 ,u2 şi u1). Aceste patru concentraţii de extract şi standard trebuie, în mod necesar, să fie plasate în fiecare placă. Pentru acest scop, se aleg plăci destul de mari pentru a se permite să fie făcute cel puţin opt godeuri cu un diametru de 1O la 13 mm şi la nu mai puţin de 30
    
    mm de centru în mediul agar. Testul poate fi efectuat pe plăci ce constau într-o placă de sticlă cu o faţă din aluminiu sau un inel din plastic plasat în vârf, 200 mm în diametru şi 20 mm înăltime.
    
    '
    
    Se toarnă în plăci o cantitate din mediul însămânţat (4.2)
    
    ca la punctul 7.1. , pentru a se obţine un strat gros de aproximativ 2 mm (60 ml pentru o placă de 200 mm diametru), se lasă să se solidifice, se formează godeuri şi se pun în acestea volume de probă măsurate cu exactitate şi soluţii standard (între O,1O şi O,15 ml per goden, conform diametrului). Se utilizează fiecare concentraţie de cel puţin patru ori astfel
    
    încât fiecare determinare să fie supusă unei evaluări a 32 zone de inhibitie.
    
    '
    
    '
  3. 7.3. lncubatie
    
    Se incubează plăcile timp de 16 până la 18 ore la 30 ± 2 °e
8. 8. Evaluare

Se măsoară diametrul zonelor de inhibiţie cu o aproximaţie de O,1 mm. Se înregistrează valorile medii pentru fiecare concentraţie pe hârtie grafică semilogaritmică ce indică logaritmul concentraţiilor în relaţie cu diametrele zonelor de inhibitie.

Se trasează liniile cele mai potrivite, atât pentru soluţia

standard cât şi pentru extract ca în exemplu de mai jos:

Se determină punctul ăcel mai potrivit" pentru cel mai scăzut nivel standard (SL) utilizând formula:

(a) SL = 7s1 + 4s2 +S4 – 2sa

Se determină punctul ăcel mai potrivit" pentru nivelul standard cel mai ridicat (SH) utilizând formula:

(a) SH = 7sa + 4S4 +s2 – 2s1

10

Se calculează în mod similar punctele ăcele mai potrivite " pentru nivelul cel mai scăzut de extract (UL) şi nivelul cel mai înalt de extract (UH), prin substituirea u1, u2, U4 şi ua cu s1, s2, s4şi s8 din formula menţionată mai sus.

Se înregistrează valorile calculate ale SL şi SH pe aceeaşi hârtie grafică şi se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită" pentru soluţia standard. Se înregistrează în mod similar UL şi UH şi se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită" pentru extract.

În absenta oricărei interferente liniile trebuie să fie

paralele. Pentr'u scopuri practice, 'liniile pot fi considerate

paralele dacă valorile (SH-SL) şi (UH-UL) nu diferă mai mult de 10% ca valoare medie a acestora.

Dacă liniile nu sunt paralele fie u1 şi s1 fie u8 şi s8 pot fi înlăturate şi SL, SH, UL şi UH calculate, utilizând formula alternativă, pentru a da liniile alternative ăcele mai potrivite":

5S1 + 2S2 – S4 5s2 + 2s4– s8

(a') SL =

sau

––sau–-

6 6
(b) SH= 5S4+2S2-S1 sau5S8+2S4-sS2

6 6

şi în mod similar pentru UL şi UH. Trebuie să fie întrunite aceleaşi criterii de paralelism. Faptul că rezultatul a fost calculat pe baza celor trei nivele trebuie să fie notat în raportul final (buletinul de analiză). Atunci când liniile sunt considerate ca fiind paralele, se calculează logaritmul (log a) activităţii relative

(A) prin intermediul uneia din următoarele formule, ce

depinzând de faptul dacă au fost utilizate trei sau patru nivele pentru evaluarea paralelismului.

Pentru patru nivele
(c) log A= (ul+u2 +u4 +ug-s1 -s2 -S4-s8 )x0,602

u4+u8 +s4+s8 -u1-u2-s1-s2

Pentru trei nivele
(d) log A= (u1 +u2+u4-s1-s2-sJx0,401

U4 +s4 -u1 -s1

(d'} log A= (u2+u4+u8-s1-s4-s8)x0,401

u8+s8-u2-s2

Activitatea extractului de probă = activitatea standardului relevant x A

(u8 = sa x A)

Dacă activitatea relativă este în afara zonei de variatie de

la 0,5 la 2,0, atunci se repetă proba făcând aju'stări

corespunzătoare ale concentraţiilor extractului sau, dacă

aceasta nu este posibil, ale soluţiilor standard. Atunci când activitatea relativă nu poate fi adusă în gama de valori solicitată, orice rezultat obţinut trebuie să fie considerat ca aproximativ şi acesta trebuie notat în raportul final (buletinul de analiză).

Atunci când liniile sunt considerate ca nefiind paralele, se repetă determinarea. Dacă paralelismul nu este încă realizat, înseamnă că nu a fost obtinută o determinare satisfăcătoare.

Se exprimă rezultatul în miligrame de zinc-bacitracină per

kilogram de furaj.

Pentru patru nivele

Diferenta între rezultatele celor două determinări efectuate

pe aceeaşi' probă prin aceeaşi analiză nu trebuie să depăşească:

2 mg/kg, în valoare absolută, pentru niveluri de zinc-bacitracină până la 1O mg/kg,

20% să fie corelată cu valoarea cea mai mare pentru niveluri de la 10 la 25 mg/kg,

5 mg/kg, în valoare absolută, pentru niveluri de la 25 la 50 mg/kg,

10% din valoarea cea mai mare pentru niveluri mai mari de 50 mg/kg

(1) 1 mg grade de zinc-bacitracină în furaj este echivalent cu 42 unităţi internaţionale (u.i.).

(a) Pot fi utilizate alte metode, cu condiţia să se fi stabilit că acestea utilizează suspensii bacteriene similare.

(b) Poate fi utilizat orice mediu de cultură comercială de compoziţie similară şi care dă aceleaşi rezultate.

2. Determinarea de flavofosfolipol prin difuziune in mediu de agar
1. 1. Domeniu şi scop
  
  Metoda este utilizată pentru determinarea flavofosfolipolului din furaje, concentrate şi premixuri. Limita inferioară de determinare este 1 mg/kg (1 ppm).
2. 2. Principiu
  
  Proba este extrasă cu metanol diluat prin încălzire sub reflux.
  
  După centrifugare, extractul este purificat (unde este necesar) prin tratarea cu răşini schimbătoare şi prin schimb de ioni şi diluat. Activitatea antibiotică a acestuia este determinată prin măsurarea difuziei de flavofosfolipol într-un mediu de agar însămânţat cu Staphyilococcus aureus. Difuzia este indicată prin formarea de zone de inhibiţie a creşterii microorganismului. Diametrul acestor zone este considerat a fi direct proporţional cu logaritmul concentraţiei de antibiotic peste gama de
  
  concentratii de antibiotic utilizate.
  
  '
3. 3. Micro-organism: Staphylococcus aureus ATCC 6538 p
  1. 3.1. Mentinerea culturii stoc
    
    '
    
    Se însămânţează mediul de cultură (4.1) în tuburi înclinate
    
    cu Staphylococcus aureus , se incubează timp de 24 de ore la 37 °e, se depozitează într-un frigider la aproximativ 4 °e şi se reînsământează în fiecare lună în tuburi înclinate.
    
    '
    
    3.2 Prepararea suspensiei bacteriene (pot fi utilizate alte
    
    metode, cu condiţia să se fi stabilit că acestea dau suspensii bacteriene similare)
    
    Se pun deoparte două tuburi ce conţin cultura stoc (3.1) şi se însămânţează săptămânal. Se incubează timp de 24 de ore la 37 °e şi se depozitează întru-un frigider la aproximativ 4 QC.
    
    Cu 24 de ore înainte de testare, se însămânţează cu această cultură două până la patru tuburi înclinate ce conţin mediul de cultură (4.1). Se incubează timp de 16 până la 18 ore la 37 °C. Se efectuează o suspensie de cultură în soluţie de clorură de sodiu (4.3). Transmisia luminoasă a suspensiei trebuie să fie de aproximativ 40%, măsurată la la lungimea de undă de 578 nm, într-o celulă de 1 cm în comparaţie cu soluţia de clorură de sodiu. (4.3)
4. 4. Mediu de cultură şi reactivi
  Ca pentru punctul 4.1, cu adăugarea a 2.0 g de emulsie siliconată anti-spumantă (de ex. SE 2 din Wacker Chemie Gmnh, Munchen).
  
  4.3. Soluţie de clorură de sodiu 0.4% (w/v): se dizolvă 4 g de clorură de sodiu a. p. în apă şi se diluează până la 1OOO ml apă sterilă.
  4.1O Schimbător de anioni: sub formă de Dowex 1 la 2, 50 la 100 mesh, ci (cat. Serva n 4101O) sau echivalent. Înainte de utilizare, se ţine timp de 12 la 14 ore în metanol 80% (4.6.)
5. 5. Aparatură
  
  5.1 Tub de sticlă pentru cromatografie, diametru intern: 9 mm, lungime: 150 la 200 mm, dotat cu un dop la partea îngustă a capătului inferior şi o legătură de sticlă-cauciuc (porţelan) pentru a se conecta cu pâlnia de scurgere (5.2). la capătul superior
  
  5.2 Pâlnie de scurgere de 250ml, dotată cu un dop şi cu o legătură sticlă – cauciuc (sau porţelan)
  1. 6. Solutii standard
    
    '
    
    Se dizolvă o cantitate cântărită corect din substanta standard (4.14) în metanol 50°/c, (4.5) şi se diluează pentru a s'e
    
    obţine o soluţie stoc ce conţine 100 ug flavofosfolipol per
    
    mililitru. Se depozitează în baloane cu buşon la 4 QC unde această soluţie este stabilă pentru mai mult de două luni.
    
    Din această soluţie stoc se prepară, prin diluţie succesivă cu metanol 50% (4.5), următoarele soluţii:
    
    Sa 0.2 ug/ml
    
    S4 0.1 ug/ml
    
    S2 0.05 ug/ml
    
    S1 0.025 ug/ml
  2. 7. Prepararea extractului
    1. 7.1. Extractie
      
      '
      1. 7.1.1. Concentrate, premixuri şi furaje minerale
        
        Se cântăreşte o cantitate de probă de 2.O la 5.O g şi se adaugă aproximativ 150 mg de acid ascorbic (4.13). Se omogenizează cu 150 ml de metanol 50% (4.5) într-un balon conic (5.3) şi se ajustează ph-ul la 8.1 până la 8.2, cu aproximativ 400 mg de tris (hidroximetil) aminometan (4.7). Se verifică ph-ul cu hârtie indicatoare (4.12). Se lasă să stea 15 minute, apoi se reajustează ph-ul de la 8.1 la 8.2 cu tris (hidroximetil) aminometan (4.7) şi se fierbe timp de 1O minute sub reflux (5.4) cu amestecare constantă. Se lasă să se răcească, se centrifughează amestecul şi se decantează extractul.
      2. 7.1.2. Alte furaje
    2. 7.2. Purificarea (acest pas poate fi omis pentru concentrate, premixuri şi furaje minerale)
      
      Se amestecă 11O ml de extract cu 11 g de schimbător de cation (4.9), se fierbe timp de un minut sub reflux (5.4) cu amestecare constantă. Se separă schimbătorul de cation prin centrifugare sau filtrare. Se amestecă 100 ml de extract cu 150 ml de metanol (4.4) şi se depozitează soluţia timp de 12 până la 15 ore la 4 °C. Se filtrează şi se îndepărtează masa de flacoane în timpul răcirii.
      
      Se inserează un dop de vată de sticlă (4.11) la capătul unui tub de sticlă (5.1), se toarnă în tub 5ml de schimbător de anioni (4.1O) şi se spală coloana cu 100 ml de metanol 80 % (4.6). Utilizând pâlnia (5.2), se transferă în coloană un volum filtrat de cel puţin 100 ml ce este de aşteptat să conţină 16 ug de flavofosfolipol (200 ml pentru o probă de 30 g de furaj la 1 ppm). Atunci când se consideră necesar, înainte de utilizarea coloanei, se diluează filtratul cu metanol 80 % (4.6) pentru a se obţine un conţinut dorit de flavofosfolipol de 16 ug/100ml. Se ajustează rata de curgere la aproximativ 2 ml / minut. Se înlătură filtratul. Apoi se spală coloana cu 50 ml de metanol 80
      
      % (4.6) şi se înlătură filtratul. Se elutează flavofospfolipolul cu soluţie metanolică de clorură de potasiu (4.8) menţinând rata de curgere la aproximativ 2 ml / minut. Se colectează 50 ml de
      
      eluat într-un balon gradat, se adaugă 30 ml de apă şi se amestecă. Această solutie ar trebui să aibă un continut de
      
      flavofosfolipol de O; 2ug /'ml (= u8). '
    3. 7.3. Solutii de testare
      
      '
      
      Atunci când ce consideră necesar (de ex. când etapa de purificare a fost omisă), se diluează extractul obţinut ca la punctul 7.1. cu metanol 50 % (4.5) pentru a se obţine un conţinut dorit de flavofosfolipol de 0.2 ug/ml (=Ua).
      
      Din soluţia U8 se prepară soluţii U4 (conţinut aşteptat: 0.1 ug I ml), U2 (conţinut aşteptat: 0.05 ug / ml) şi U1 (conţinut aşteptat: 0.025 ug / ml) prin intermediul diluţiei succesive (1/1) cu metanol 50% (4.5).
  3. 8. Procedura de efectuare a testării
    1. 8.1. Însăn,ânţarea mediului de probă
      
      Se însămânţE ază rnediul de testare (4.2.2) cu suspensie bacteriană (3.2) la aproximativ fiO °C. Prin testări preliminare pe plăci cu mediu de testare (4.2.2.) se determină cantitatea de suspensie bacteriană necesară pentru a indica cele mai mari şi
      
      mai curate zone de inhibitie obtinute cu diferite concentratii de
      
      flavofosfolipol (aproximativ' 30 m'l/ litru). '
      
      8.2 Pregătirea placilor
      
      Difuzia pe agar este efectuată în plăci utilizându-se patru concentraţii din s.oluţia standard (S8, 84, S2, S1) şi patru concentraţii din soluţia de testare (U8, IU4, U2, U1). Aceste patru concentraţii de extract şl cele standard trebuie, în mod obligatoriu, să fie plasate în fiecare placă. Pentru acest scop, se aleg pliîci destul de mari pentru a permite să se efectueze cel puţin opt godeuri în rnediu de agar cu un diametru de 1O până la 13 mrn şi nu n1ai puţin de 30 mn, de centru. Testul poate fi efectuat pe plăci ce constau într-o placă de sticlă cu o faţadă din aluminiu sau un inel din plastic plasat în vârf, 200 mm în dian1etru şi 20 mm înălţ:ime.
      
      Se toarnă în plăci o cantitate din rnediu (4.2.1) pentru a se obţine un strat gros ele aproximativ 1,5 mm (45 ml pentru o placă de 200 rnrn diametru). Se lasă să se solidifice şi apoi peste st.rat cu o cantitatei din mediu (4. –2) ,se însămânţează ca la punctul 8.1, pentru a se obţine un strat gros de 1 mm (30 ml pentru o placă d•3!2′.00 mrn diannetru). Se lasă să se solidifice din nou1 se efectuează godeuri şi se pun în acestea volume de probă, măsurate cu exactitate şi soluţii standard (între O,1 O şi O,15 ml per gaură) conform diametrului).
      
      Se utilizează fiecare concentraţie de cel puţin patru ori, astfel încât fiecare determinare să fie supusă unei evaluări a 32 zone ele inhibitir1.
      
      '
      
      8.3. Incubare
      
      Se incubează plăcile timp de 16 p ină la 18 ore, la 28 până la 30 QCă
  4. 9. Evaluare
  Se măsoară diametrul zonelor de inhibiţie cu o aproximaţie de 0-1 mm. Se înregistrează valorile •medii pentru fiecare concentraţie pe hârtie grafică semi-logaritmică ce indică logaritmul concentraţiilor în relaţie cu diametrele zonelor de
  
  inhibitie.
  
  '
  
  Se trasează liniile cele mai potrivite, atât pentru soluţia
  
  standard cât şi pentru extract , ca în exemplu de mai jos:
  
  Se determină punctul ăcel mai potrivit" pentru cel mai scăzut nivel standard (SL) utilizând formula:
  1. (a) SL= 1s1+4s2+s4-2s3
    
    10
  2. (b) SH= 7S8 +4S4 +S2 -2S1
    
    10
    
    Se calculează în mod similar punctele ăcele mai potrivite " pentru nivelul cel mai scăzut de extract (UL) şi nivelul cel mai înalt de extract (UH), prin substituirea u1, u2, U4 şi ua cu s1, s2, S4 şi s8 din formula menţionată mai sus.
    
    Se înregistrează valorile calculate ale SL şi SH pe aceeaşi hârtie grafică şi se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită" pentru soluţia standard. Se înregistrează în mod similar UL şi UH şi se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită" pentru extract.
    
    În absenta oricărei interferente, liniile trebuie să fie
    
    paralele. Pentr'u scopuri practice, 'liniile pot fi considerate
    
    paralele dacă valorile (SH-SL) şi (UH-UL) nu diferă mai mult de 10% ca valoare medie a acestora.
    
    Dacă liniile nu sunt paralele fie u1 şi s1 fie u8 şi s8 pot fi înlăturate şi SL, SH, UL şi UH calculate, utilizând formula alternativă, pentru a da liniile alternative ăcele mai potrivite":
    
    (a') SL= –5–S–1–+-„2–S–2––‘S–4––‘5-SS2a+U2–S-„4‘-––S–8‘-
    
    6 6
    
    (b') SH= 5S4 + 2S2 -sl sau 5S8 + 2S4 -S2
    
    6 .,… 6
    
    şi în mod similar pentru UL şi UH. Liniile alternative cele mai potrivite trebuie să fie verificate pentru paralelism ca mai
    
    înainte. Faptul că rezultatul a fost calculat pe baza celor trei nivele, trebuie să fie notat în raportul final·(buletinul de analiză).
    
    Atunci când liniile sunt considerate ca fiind paralele, se calculează logaritmul activităţii relative (log A) prin intermediul uneia din următoarele formule
  3. (c) log A= (u, +u2+u4 +U8-s, -s2-S4-S8)xo,602
    
    U4 +U8 +S4 +S8 -u1 -u2 -s,-s2
    
    Pentru trei nivele
  4. (d) log A= (u, +U2 +U4 -S -S2 -SJx0,401
  U4 +S4 -U1 -S1
  
  sau
  
  (d') log A= (U2+U4 +Ug-s, -s4-Ss)x0,401
  
  U8+S8-U2-S2
  
  Activitate reală = activitate presupusă X activitate relativă Atunci când liniile sunt considerate ca nefiind paralele, se
  
  repetă determinarea. Dacă paralelismul nu este încă realizat, se
  
  calculează logaritmul activităţii relative (log. A) prin intermediul formulei (c). Rezultatul obţinut trebuie totuşi să fie considerat ca aproximativ şi acesta trebuie să fie notat în raportul final (buletinul de analiză).
  
  1o. Repetabilitate
  
  Diferenta între rezultatele celor două determinări efectuate
  
  pe aceeaşi 'probă prin aceeaşi analiză nu trebuie să depăşească:
  - – 0,5 mg/kg, în valoare absolută, pentru conţinutul de flavofosfolipol de la 1 până la 2 mg /kg
  - – 25% să fie corelată cu valoarea cea mai mare pentru un conţinut mai mare de 2 şi până la 1O mg/kg
  - – 20% să fie corelată cu valoarea cea mai mare pentru un conţinut mai mare de 1O şi până la 25 mg/kg,
  - – 5 mg/kg, în valoare absolută, pentru un conţinut mai mare de 25 mg/kg şi până la 50 mg/kg, 10% fiind corelată cu valoarea cea mai mare pentru un conţinut de aproximativ 50 mg/kg

3. Determinarea oligoelementelor: fier, cupru, mangan şi zinc

1. Domeniu şi scop

Metoda face posibil să se determine oligoelementele fier, cupru, mangan şi zinc din furaje. Limitele inferioare de determinare sunt:

Fier (fe): 20 mg/kg Cupru (cu): 1O mg/KG Mangan (mn): 20mg/kg Zinc (zn): 20 mg/kg
2. Principiu

Proba este introdusă în soluţie de acid clorhidric după distrugerea materiilor organice, dacă este cazul. Elementele fier, cupru, mangan şi zinc sunt determinate după o diluare corespunzătoare, prin spectrometrie de absorbţie atomică.
3. Reactivi

Comentarii introductive

Pentru prepararea reactivilor şi soluţiilor analitice se utilizează apă liberă de cationii ce trebuie, în consecinţă, determinaţi, obţinută fie prin distilare dublă a apei într-o sticlă de borosilicat sau cuarţ sau prin tratament dublu pe răşină schimbătoare de ioni.

Reactivii trebuie să fie de acelaşi grad analitic(p.a). Eliberarea elementului ce trebuie determinat trebuie să fie determinată printr-un experiment ăorb". Dacă este necesar, reactivii trebuie să fie purificaţi ulterior.

în locul soluţiilor standard, descrise mai jos, pot fi utilizate solutii comerciale standard, cu conditia ca acestea să fie

gara'ntate şi verificate înainte de utilizare.'

3.1 Acid clorhidric p.a.(d: 1.19}
3.1O Soluţia standard de zinc (1OOO □g Zn / ml) preparată după cum urmează: se dizolvă 1g de zinc sub formă de folie (p.a) în 25 ml de acid clorhidric 6n (3.2) şi se aduce la un litru cu apă.

3.10.1 Soluţia standard de zinc de lucru (1O □g Zn /ml) preparată prin diluarea soluţiei standard (3.1O) 1/9 cu apă şi apoi diluarea soluţiei ce rezultă 1/ 9 cu apă.

3.11 Soluţie de clorură de lantan preparată după cum urmează: se dizolvă 12 g de oxid de lantan în 150 ml de apă,

se adaugă 100 ml de acid clorhidric 6 n (3.2) şi se aduce la un litru cu apă.
4. Aparatură
1. 4.1. Cuptor cu muflă cu temperatură reglabilă şI înregistrare
2. 4.2. Sticlăria trebuie să fie rezistentă, de tip borosilicat şi se recomandă să se utilizeze aparate ce sunt rezervate în mod exclusiv pentru determinări de oligoelemente.
3. 4.3. Creuzete de platină şi creuzete de cuarţ
4. 4.4. Spectrometru de absorbţie atomică ce întruneşte cerinţele metodei cu privire la sensibilitatea şi precizia gamei de valori solicitate.

5. Procedură

5.1. Probe ce conţin materie organică

5.1.1. Incinerarea şi prepararea soluţiei pentru analiză (*)

(i) se pun 5 până la 1O g de probă, cântărită cu o aproximaţie de O ,2 mg, într-un creuzet de cuarţ sau platină (4.3) (vezi nota(b)), se sicatează într-un cuptor la 105 °C şi se introduce creuzetul în cuptorul cu muflă rece (4.1). Se închide cuptorul (vezi nota (c)) şi se ridică în mod gradat temperatura de la 450 la 475 QC timp de aproximativ 90 minute. Se menţine această temperatură timp de 4 până la 16 ore (de ex. peste noapte) pentru a se îndepărta materialul carbonatat şi apoi se deschide cuptorul şi se lasă să se răcească (vezi nota (d.))

Se spală creuzetul cu un total de aproximativ 5 ml de acid clorhidric (3.1) şi acesta din urmă se adaugă încet şi cu atenţie în capsula (poate surveni o reacţie viguroasă datorită formării de CO2). Se adaugă acidul clorhidric (3.1) sub formă de picătură, cu agitare până când se stopează toată efervescenţa. Se evaporă la sec, amestecând din când în când cu o bagheta de sticlă.

(*) Este posibil ca furajul verde (proaspăt sau uscat) să conţină o cantitate mare de siliciu vegetal, ce poate reţine oligoelemente şi trebuie să fie, de aceea, îndepărtat. Pentru probe din aceste furaje, deci, trebuie să fie urmată următoarea procedură modificată

Se efectuează operaţiunea 5.1.1 (I) până la filtrare. Se spală hârtia de filtru ce conţine reziduul ·insolubil, de două ori, cu apă fiartă şi se pune într-un creuzet din platină (4.3.). Se dă foc furnalului cu muflă (4.1) la o temperatură mai mică de 550

°C până când tot materialul carbonatat a dispărut complet. Se lasă să se răcească, se adaugă câteva picături de apă, apoi se adaugă între 1O – 15 ml de acid fluorhidric (3.4) şi se evaporă până la uscare, la aproximativ 150 °C. Dacă mai rămâne siliciu în reziduu, se dizolvă în câţiva mililitri de acid fluorhidric (3.4) şi se evaporă până la uscare. Se adaugă cinci picături de acid sulfuric (3.5) şi se încălzeşte până când nu mai este degajat nici un vapor alb. După adăugarea a 5 ml de acid clorhidric 6 n (3.2) şi aproximativ 30 ml de apă, se încălzeşte, se filtrează soluţia într-un balon gradat de 250 ml şi se umple până la semn cu apă (concentraţie de acid clorhidric aproximativ 0,5n). Se procedează apoi cu determinarea de la punctul 5.1.3.

Apoi se adaugă 15 ml de acid clorhidric 6 n (3.2) la reziduul rezultat urmat de aproximativ 120 ml de apă. Se amestecă cu bagheta de sticlă ce trebuie să fie lăsată în capsula şi se acoperă capsula cu o sticlă de ceas. Se aduce uşor la fierbere şi se menţine la punctul de fierbere până când se observă că nu se mai dizolvă. Se filtrează cenuşa cu hârtie de filtrare şi se colectează filtratul într-un balon gradat, se spală capsula şi se filtrează cu 5 ml de acid clorhidric 6n fierbinte (3.2) şi de două ori cu apă fiartă. Se completează balonul gradat până la semn cu apă (concentraţie de HCI aproximativ 0.5 N).
(ii) dacă reziduul din filtru apare negru (particule de carbon), se pune înapoi în cuptor şi se incinerează din nou la 450 până la 475 °C . Această incinerare, ce solicită doar câteva ore (aproximativ trei până la cinci ore), se realizează până când cenuşa pare albă sau aproape albă. Se dizolvă reziduul cu aproximativ 2 ml de acid clorhidric (3.1), se evaporă până la sec şi se adaugă 5 ml de acid clorhidric 6N (3.2). se încălzeşte, se filtrează soluţia în balonul gradat şi se completează până la semn cu apă.

Zinc

µg Zn/ml

0.05

0.1

0.2.

0.4

0.6

0.8

ml solutie standard d' e

lucru (3.8.1)

(1 ml = 1O µg Zn) +ml 6N HCI

0.5

+1O ml de soluţie de clor lantan (3.11) şi se completează până la 100 ml cu apă.

5.1.2.2. Prepararea soluţiei pentru analiză

Pentru determinarea de cupru, soluţia preparată ca la punctul 5.1.1. poate fi utilizată, în mod normal, direct. Dacă este necesar să se aducă concentraţia în cadrul gamei soluţiilor de calibrare, o porţiune alicotă poate fi pipetată într-un balon gradat şi se completează până la semn cu acid clorhidric 0.5 n. (3.3).

Pentru determinarea de fier, mangan şi zinc, se pipetează o porţiune alicotă din soluţia preparată la punctul 5.1.1. într-un balon gradat de 100 ml, se adaugă 1O ml de soluţie de clor lantan (3.11) şi se completează până la semn cu acid clorhidric

11

0.5 n (3.3) (vezi, de asemenea, punctul 8 observaţie")
5.1.2.3. Experiment ăorb”

Experimentul 11orb” trebuie să includă toate etapele prescrise de procedură, cu excepţia faptului că materialul de probă este omis.

Solutia de calibrare

11

'

011 nu trebuie să fie utilizată ca ăorb”.
5.1.2.4. Măsurarea absorbtiei atomice

Se măsoară absorbţia atomică a soluţiilor de calibrare şi a

solutiei ce trebuie analizată, utilizându-se o flacara oxidantă de aer-a' cetilenă la următoarele lungimi de undă:

AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR

O R D I N

pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește metoda de calcul pentru valoarea energetică a furajelor combinate pentru păsări*)

Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia,

văzând Referatul de aprobare nr. 153.185 din 26 mai 2004 al Direcției generale veterinare,

președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin:

Art. 1. — Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metoda de calcul pentru valoarea energetică a furajelor combinate pentru păsări, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art. 2. — Institutele centrale de profil, direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a

municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Art. 3. — Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin.

Art. 4. — Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor,

Liviu Harbuz

București, 10 iunie 2004.

Nr. 17.

*) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 17/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis.

**) Anexa este reprodusă în facsimil.

ANEXĂ

NORMĂ VETERINARĂ

ce stabilește metoda de calcul pentru valoarea energetică a furajelor combinate pentru păsări

METODA DE CALCUL

a valorii energetice a furajelor pentru păsări

ANEXĂ

la norma veterinară

AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR

O R D I N

pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește metode de analiză pentru controlul oficial

al furajelor cu privire la conținutul în acid cianhidric, calciu, carbonați, cenușă brută, cenușă brută insolubilă în acid clorhidric, clor din cloruri, ulei de muștar, lactoză, potasiu, sodiu, zahăr,

uree și estimarea activității ureazice a produselor derivate din soia*)

Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia,

văzând Referatul de aprobare nr. 153.878 din 27 mai 2004 al Direcției generale veterinare,

președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin:

Art. 1. — Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu privire la conținutul în acid cianhidric, calciu, carbonați, cenușă brută, cenușă brută insolubilă în acid clorhidric, clor din cloruri, ulei de muștar, lactoză, potasiu, sodiu, zahăr, uree și estimarea activității ureazice a produselor derivate din soia, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art. 2. — Institutele centrale de profil, direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Art. 3. — Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prevederilor prezentului ordin.

Art. 4. — Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor,

Liviu Harbuz

București, 10 iunie 2004.

Nr. 18.

*) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 18/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis.

**) Anexa este reprodusă în facsimil.

ANEXĂ

NORMĂ VETERINARĂ

ce stabilește metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor

cu privire la conținutul în acid cianhidric, calciu, carbonați, cenușă brută, cenușă brută insolubilă în acid clorhidric, clor din cloruri, ulei de muștar, lactoză, potasiu, sodiu, zahăr, uree și estimarea activității ureazice

a produselor derivate din soia

ANEXĂ

la norma veterinară

controlul oficial al furajelor privind umiditatea, bazele azotate volatile, fosforul total şi uleiurile şi grăsimile brute"

3. Procedură

Se amestecă bine proba finală, fie mecanic sau manual. Se împarte proba în două părţi egale (poate să fie utilizată metoda de împărţire în patru când este cazul). Se menţine una din porţiuni într-un container corespunzător, curat şi uscat, echipat cu un dop etanş şi se pregătesc din cealaltă porţiune sau dintr-o porţiune reprezentativă a acesteia, cel puţin 100g, aşa cum s-a indicat mai jos.
1. 3.1. Furaje ce pot fi măcinate ca atare
  
  Cu excepţia cazului când nu s-a specificat de metodele de analiză, după măcinare, dacă e necesar, se cerne întreaga probă printr-o sită cu ochiuri de 1mm (în conformitate cu Recomandarea ISO R 565). Se evită orice supra-măcinare.
  
  Se amestecă proba măcinată şi se colectează într-un container corespunzător, curat şi uscat, echipat cu un dop etanş. Se amestecă din nou, imediat înainte de cântărirea cantităţii pentru analiză.
2. 3.2. Furaje ce pot fi măcinate după uscare
  
  Cu excepţia cazului când nu s-a specificat de metodele de analiză, se usucă proba pentru a se aduce conţinutul în umiditate al acesteia la un nivel scăzut de 8-12%, în conformitate cu procedura preliminară de uscare descrisă în baza punctului 4.3. al metodei de determinare a umidităţii menţionată la secţiunea 2 de mai sus. Se procedează apoi aşa cum s-a indicat la sectiunea 3.1.
3. 3.3. Furaje lichide sau' semi-lichide
  
  Se colectează proba într-un container corespunzător, curat şi uscat, echipat cu un dop etanş. Se amestecă bine imediat înainte de cântărirea cantităţii pentru analiză.
4. 3.4. Alte furaje
  
  Probele ce nu pot fi preparate în conformitate cu una din procedurile anterioare trebuie să fie tratate prin orice altă procedură ce asigură că, în fapt, cantităţile cântărite pentru analiză sunt omogene şi reprezentative pentru probele finale.

4. Depozitarea probelor

Probele trebuie să fie depozitate la o temperatură ce nu va

altera compoziţia acestora. Probele destinate pentru analiza vitaminelor sau a substantelor ce sunt sensibile în mod deosebit

la lumină, trebuie să fie 'depozitate în containere cu geamuri

fumurii.

B. Prevederi în legătură cu reactivii şi aparatura utilizată la metodele de analiză.

1. Numai dacă nu s-a specificat la metodele de analiză, toţi reactivi analitici trebuie să fie puri din punct de vedere analitic.(a.p.). Când se determină micro-elemente, puritatea reactivilor trebuie să fie controlată printr-un test martor. În funcţie de rezultatele obţinute, poate să fie necesară o purificare suplimentară a reactivilor.
2. Orice operaţiune ce implică pregătirea soluţiilor, diluarea, clătirea sau spălarea, menţionate de metodele de analiză, fără indicaţie în ceea ce priveşte natura solventului sau a diluantului întrebuinţat, implică faptul, că trebuie să fie utilizată apă. Ca regulă generală, apa trebuie să fie demineralizată sau distilată. În cazuri particulare ce sunt indicate de metodele de analiză, aceasta trebuie să fie supusă unor proceduri speciale de purificare.
3. În legătură cu echipamentul aflat în mod normal în

laboratoarele de control metodele de analiză fac referire numai la acele instrumente sau aparate ce sunt speciale sau necesită utilizare specifică. Acestea trebuie să fie curate, în special

atunci când trebuie să fie determinate cantităti foarte mici de

substante. '

C. Aplicarea metodelor de analiză şi exprimarea rezultatelor

1. Este stabilită, în general, o singură metodă de analiză pentru determinarea fiecărei substanţe din furaje. Atunci când sunt prezentate câteva metode, trebuie să fie indicată, în raportul de analiză, metoda specifică utilizată de laboratorul de control.

2. Rezultatul prezentat de raportul de analiză trebuie să fie valoarea medie obţinută de la cel puţin două determinări,

efectuate pe porţiuni separate de probă şi de o repetabilitate satisfăcătoare.

Acest rezultat trebuie să fie exprimat în maniera stabilită de metoda de analiză, cu un număr corespunzător de cifre semnificative şi trebuie să fie corectat, dacă este necesar, în funcţie de conţinutul de umiditate al probei finale anterior preparării.

Pregătirea probei pentru analiză

Este esenţial ca analizele chimice să fie efectuate pe o probă omogenă. Este totuşi posibil să se efectueze unele determinări macroscopice sau microscopice şi de asemenea, determinarea umidităţii, din probă în starea în care aceasta ajunge la laborator. Pentru a satisface aceste două cerinţe, proba va fi divizată în două părţi. O parte va fi păstrată aşa cum este, iar cealaltă poate va fi preparată pentru analiză chimică, după cum urmează. Se divide proba cu aparatură mecanică sau manual, după amestecarea cu grijă a întregii probe pe o suprafaţă curată şi uscată. În caz extrem este preferabil să se utilizeze metoda de divizare în sferturi ce constă în prelevarea de probe pe rând din două secţiuni opuse. În cele din urmă se delimitează pentru analiză o porţiune ce cântăreşte aproximativ 100g şi dacă e necesar, aceasta se mărunţeşte, astfel încât întreaga probă trece printr-o sită cu ochiuri de 1mm. Se transferă imediat această probă într-un container uscat, etanş şi se sigilează.

Dacă proba este foarte umedă, aceasta trebuie să fie pre uscată, pentru a se aduce conţinutul umidităţii la un nivel scăzut, între 8 şi 12%. Pentru a se realiza aceasta, se usucă proba la o temperatură potrivită pentru o perioadă de timp adecvată.

Reactivi şi aparatură

La descrierea metodelor de analiză sunt mentionate numai

instrumente sau aparate speciale sau cele ' ce necesită

standarde speciale. Nu se consideră necesar să se menţioneze

toate aparatele sau instrumentele ce fac parte din echipamentul de zi cu zi al laboratoarelor de testare.

De asemenea, acolo unde este menţionată apa, în legătură cu realizarea diluării sau spălării, aceasta înseamnă apă distilată. În mod similar, acolo unde este menţionată soluţia

unui reactiv, fără orice altă indicatie, aceasta înseamnă o

soluţie în apă distilată. '

E primarea rezultatelor

Rezultatul specificat de certificatul de analiză trebuie să fie valoarea medie obţinută pe baza a cel puţin două testări. Supus unor prevederi speciale, acesta trebuie să fie exprimat ca un procentaj din proba originală, aşa cum a fost când acesta a ajuns la laborator. Nu trebuie să fie prezentat rezultatul cu cifre mai semnificative decât permite acurateţea metodei de analiză.

2. Determinarea acidului cianhidric
1. 1. Scop şi domeniu de aplicare
  
  Această metodă face posibilă determinarea nivelului acidului cianhidric, liber şi combinat sub forma glicozidelor, în furaje şi în particular în produse derivate din seminţe de in, din făină de manioc şi din unele specii de fasole.
2. 2. Principiu
  
  Proba este suspendată în apă. Acidul cianhidric este eliberat prin acţiunea enzimelor, antrenat prin distilare cu aburi şi colectat într-un volum specific de soluţie acidifiată de nitrat de argint. Cianura de argint este separată prin filtrare, iar excesul de nitrat de argint este titrat cu o soluţie de tiocianat de amoniu.
3. 3. Reactivi
  1. 3.1. O suspensie de migdale dulci: se zdrobesc 20 de migdale dulci confiate în 100 ml de apă la 37-40°C. Se controlează să nu existe acid cianhidric în cei 1O ml ai suspensiei, utilizând hârtie de picrat de sodiu sau efectuând un test martor, aşa cum este descris la ultimul paragraf al punctului 5.
4. 4. Aparatură
  1. 4.1. Cuptor cu termostat fixat la 38°C.
  2. 4.2. Aparat pentru distilare prin antrenare cu aburi, echipat cu un refrigerent cu o piesă extinsă curbată.
  3. 4.3. Baloane de 1000ml cu fundul plat cu dop de sticlă
  4. 4.4. Baie de ulei
  5. 4.5. Biurete gradate de 1120ml.
5. 5. Procedură
  
  Se cântăresc 2Og din probă, cu o aproximaţie de 5mg, se introduc într-un balon cu fund plat de 1000ml şi se adaugă 50ml de apă şi 10ml de suspensie de migdale dulci (3.1). Se pune dopul la balon şi se transferă în cuptor, timp de 16ore la 38°C. Se răceşte apoi la temperatura camerei şi se adaugă 80ml de apă, 10ml de soluţie de acetat de sodiu(3.2) şi o picătură din emulsia anti-spumă (3.3).
  
  Se conectează balonul la aparatul de distilare şi se introduce într-o baie de ulei ce a fost mai întâi adusă la o
  
  temperatură cu puţin peste 1oo0c. Se distila 200ml până la
  
  300ml de lichid, trecând un puternic curent de aburi prin balon şi încălzind uşor baia de ulei. Se colectează distilatul într-un pahar Erlenmeyer protejat de lumină şi care conţine exact 50ml de soluţie de azotat de argint O,O2N (3.5) şi 1ml de acid azotic (3.4). Trebuie să se asigure că tubul prelungitor al refrigerentului este imersat într-o soluţie de nitrat de argint.
  
  Se transferă conţinutul din paharul Erlenmeyer într-un balon cotat de 500ml, se completează cu apă, se omogenizeaza şi se filtrează. Se iau 250ml din filtrat, se adaugă aproximativ 1ml de soluţie de sulfat feric de amoniu (3.7) şi se titrează înapoi excesul de nitrat de argint cu soluţie de tiocianat
  
  de amoniu 0,02N (3.6)provenita dintr-o biuretă gradată de 1120ml.
  
  Un test martor poate să fie efectuat, dacă este necesar,
  
  aplicând aceeaşi procedură la 10ml de suspensie de migdale dulci (3.1), omiţând că proba trebuie analizată.
6. 6. Calcularea rezultatelor
  
  Dacă testul martor indică faptul că soluţia de azotat de argint 0,02 n a fost consumată, se scade valoarea acesteia din volumul consumat de distilatul probei. 1ml de AgNO3 0,02 n corespunde la 0,54 mg de HCN. Se exprimă rezultatul procentual.
7. 7. Observatii
Dacă 'proba conţine o cantitate mare de sulfiţi (ex. boabe

de fasole}, se formează un precipitat negru de sulfit de argint ce este filtrat împreună cu un depozit de cianură de argint. Formarea acestui precipitat cauzează o pierdere de soluţie de nitrat de argint 0,02n, volum ce trebuie să fie scăzut din volumul utilizat pentru a calcula conţinutul de HCN. Pentru a face aceasta, se procedează după cum urmează:

Se tratează depozitul rămas pe un filtru cu 50ml de amoniac (3.8), pentru a se dizolva cianura de argint. Se spală reziduul în amoniac diluat şi apoi se determină conţinutul în argint al acestuia. Se converteşte valoarea obţinută în ml de soluţie de azotat de argint 0,02 N.

Conţinutul în HCN al probei poate fi, de asemenea, determinat prin titrarea filtratului amoniacal acidifiat, cu acid azotic.
3. Determinarea calciului
1. 1. Scop şi domeniu de aplicare
  
  Metoda face posibilă determinarea calciului total din furaje.
2. 2. Principiu
  
  Proba de analizat este calcinata, cenuşa tratată cu acid clorhidric, iar calciul precipitat sub forma de oxalat de calciu. Se dizolvă precipitatul în acid sulfuric şi se titrează acidul oxalic ce se formează cu o solutie de permanganat de potasiu.
  
  ' '
3. 3. Reactivi
  1. 3.1. Acid clorhidric p.a., d20=1,14g/ml
  2. 3.2. Acid azotic p.a.,d 20= 1,40 g/ml
  3. 3.3. Acid sulfuric p.a., d20= 1,13 g/ml
  4. 3.4. Amoniac p.a., d20=O,89 g/ml
    
    l
  5. 3.5. Solutie saturată la rece de oxalat de amoniu p.a..
  6. 3.6. Soluţie 3O°/c, (w/v) de acid citric p.a..
  7. 3.7. Soluţie 5°/o (w/v) de clorură de amoniu p.a.
  8. 3.8. Soluţie 0,04% (w/v) de verde brom crezol
  9. 3.9. Soluţie de permanganat de potasiu O,1n
4. 4. Aparatură
  1. 4.1. Cuptor electric cu circulaţie a aerului şi termostat.
  2. 4.2. Creuzete din platină, siliciu sau porţelan pentru calcinare.
  3. 4.3. Creuzete filtrante cu frita din sticlă de porozitate G4.
  4. 4.4. Baie de apa.
5. 5. Procedura
  
  Se cântăresc aproximativ 5g din probă (sau mai mult dacă este necesar) cu o precizie de 1 mg, se calcinează la 55O°c şi se transferă cenuşa într-un pahar de laborator de 250ml.
  
  Se adaugă 40ml de acid clorhidric (3.1), 60ml de apă şi câteva picături de acid azotic (3.2). Se aduce la fierbere şi se menţine la punctul de fierbere timp de 30 de minute. Se răceşte şi se transferă soluţia într-un balon cotat de 250ml. Se clăteşte, se completeaza la semn cu apa, se omogenizează şi se filtrează.
  
  Utilizând o pipetă, se transferă într-un pahar de laborator de 250ml, o cantitate ce conţine 1O până la 40mg de calciu, în conformitate cu conţinutul în calciu asumat. Se adaugă 1ml de soluţie de acid citric (3.6) şi 5ml de soluţie de clorură de amoniu (3.7).
  1. 5. Se dilueaza cu apă volumul până la aproximativ 100ml.
    
    Se aduce până la punctul de fierbere, se adaugă 8 până la 1O picături de soluţie de verde brom crezol (3.8) şi 30ml de soluţie fierbinte de oxalat de amoniu (3.5). Dacă se formează un precipitat, acesta se dizolvă adăugând câteva picături de acid clorhidric (3.1).
    
    Se neutralizează lent cu amoniac (3.4), sub agitare constanta până la obtinerea unui pH de 4.4 pana la 4.6 (ex.: Atunci când indicatorul îşi schimbă culoarea). Se plasează paharul de laborator într-o baie de apă la fierbere şi se mentine timp de 30 de minute, pentru a permite precipitatului ce s-a format să se depună. Se scoate paharul de laborator din baia de apă. Se lasă ca acesta să stea timp de o oră şi se filtrează printr-un creuzet filtrant tip G4.
    
    Se spală paharul de laborator şi creuzetul cu apa pana la eliminarea completa a excesului de oxalat de amoniu, constatat prin absenta ionului clor in apa de spalare
    
    Se dizolvă precipitatul de pe filtru în 50ml de acid sulfuric fierbinte (3.3). Se clăteşte creuzetul cu apă fierbinte şi se
    
    completează filtratul până la aproximativ 100ml. Se aduce temperatura până la 70-ao0c şi se titrează picătură cu picătură cu o soluţie de permanganat de potasiu (3.9) până când este
    
    obţinută o culoare roz ce durează timp de 1 minut.
6. 6. Calcularea rezultatelor
  
  1ml de permanganat de potasiu O,1 n corespunde la 2,004 mg de calciu. Se exprimă rezultatul obţinut procentual.
7. 7. Observatii
  1. 7.1. P' entru un continut foarte scăzut de calciu se
procedează după cum urm' ează: se filtrează precipitatul de

oxalat de calciu printr-o hârtie de filtru liberă de cenuşă. După spălare se usucă filtrul şi cenuşa la sso0c într-un creuzet de platină. Se redizolvă reziduul în câteva picături de acid sulfuric

(3.3), se evaporă până la sec, se calcinează din nou la 550°C şi se cântăreşte. Dacă w este greutatea sulfatului de calciu obţinut, conţinutul în calciu a cantităţii luată ca o probă = W x 0,2944.

7.2 Dacă proba constă numai din substante minerale,

I A

aceasta se dizolvă în acid clorhidric fără a o calcina mai întâi. ln

cazul produselor precum fosfatul de aluminocalcic ce este dificil de dizolvat în acid, se dizolvă după cum urmează printr-un proces alcalin înainte de dizolvare: se amestecă bine proba ce trebuie analizată într-un creuzet de platină cu un amestec de cinci ori greutatea acesteia, constând în cantităţi egale de carbonat de potasiu şi carbonat de sodiu. Se încălzeşte cu grijă

până când amestecul este dizolvat complet. Se răceşte şi se dizolvă în acid clorhidric.

7.3. Se precipită oxalatul de calciu a doua oară, dacă conţinutul în magneziu al probei este ridicat.
4. Determinarea carbonatilor

'
1. 1. Scop şi domeniu de aplicare
  
  Această metodă face posibil să se determine cantitatea de carbonaţi, exprimată convenţional ca şi carbonat de calciu în majoritatea furajelor.
  
  Totuşi, în unele cazuri, trebuie să fie utilizată o metodă specială (de ex.: cu carbonat de fier).
2. 2. Principiu
  
  Carbonaţii sunt descompuşi în acid clorhidric.
  
  Dioxidul de carbon eliberat este colectat într-un tub gradat, iar volumul acestuia comparat cu cel eliberat în aceleaşi condiţii, printr-o cantitate cunoscută de carbonat de calciu p.a.
3. 3. Reactivi
  1. 3.1. Acid clorhidric, d=1,1Og/ml.
  2. 3.2. Carbonat de calciu, p.a
  3. 3.3. Acid sulfuric, aproximativ O,1n, colorat cu roşu metil.
4. 4. Aparatură
  
  Aparatură Scheibler – Dietrich (vezi diagrama) sau aparatura echivalentă.
5. 5. Procedura
  
  în conformitate cu conţinutul în carbonaţi al probei, se cântăreşte o porţiune a probei, aşa cum se arata în continuare: 0,5g pentru produse ce conţin de la 50 la 100% carbonaţi, exprimaţi ca şi carbonat de calciu
  
  1g pentru produse ce conţin de la 40 la 50% carbonaţi, exprimaţi ca şi carbonat de calciu.
  
  2-3g pentru alte produse.
  
  Se plasează porţiunea probei într-un recipient special (4) a aparaturii, echipată cu un tub mic din material indestructibil ce conţine 1O ml de acid clorhidric (3.1) şi se conectează recipientul la aparatură. Se deschide robinetul cu trei căi (5), astfel încât tubul(1) se conectează cu exteriorul. Se aduce
  
  nivelul lichidului la nivelul de sus, până la semnul zero, utilizând tubul mobil (2) ce este plin cu acid sulfuric colorat (3.3) şi conectat la tubul gradat (1). Se deschide robinetul pentru a se conecta tuburile (1) şi (3) şi se verifică dacă nivelul este la zero.
  
  Se dă drumul încet la acid clorhidric (3.1) peste porţiunea
  
  de probă, aplecând recipientul(4). Se egalizează presiunea coborând tubul (2); Se agită recipientul (4) până când se opreşte complet eliberarea de dioxid de carbon.
  
  Se restaurează presiunea aducând lichidul din tuburile (1) şi (2) înapoi la acelaşi nivel. Se citeşte după câteva minute, atunci când volumul de gaz a devenit constant.
  
  Se efectuează un test de control în aceleaşi condiţii pe 0,5g de carbonat de calciu (3.2).
6. 6. Calcularea rezultatelor
  
  Conţinutul de carbonaţi în grame, exprimat ca şi carbonat de calciu, ca procent din probă, este calculat utilizând formula:
  
  Vx100 Tx2W
  
  unde:
  
  V=ml de CO2
  
  T= greutatea în grame a porţiunii de probă W= greutatea în grame a porţiunii de probă
7. 7. Observatii
  1. 7.1. At' unci când porţiunea din probă cântăreşte mai mult
    
    de 2g, se plasează mai întâi 15ml de apă distilată în recipient(4) şi se amestecă înainte de a începe testarea. Se utilizează acelaşi volum de apă pentru testul de control.
  2. 7.2. Dacă aparatura utilizată are un volum diferit de cel al aparatului Scheibler – Dietrich, porţiunile prelevate din probă şi din substanţa de control şi calcularea rezultatelor trebuie să fie adaptate în consecinţă.
5. Determinarea cenuşii brute

1. Scop şi domeniu de aplicare

Această metodă face posibilă determinarea conţinutului de cenuşă brută al furajelor.
2. Principiu

Proba este calcinată la 550°C; este cantarit rezidiul.
3. Reactivi

Soluţie 20°/o (w/v) de azotat de amoniu.
4. Aparatură
1. 4.1. Plita încinsă;
2. 4.2. Cuptor electric cu termostat.
3. 4.3. Creuzete pentru calcinare confecţionate din platină sau dintr-un aliaj din platină şi aur (10%Pt, 90% Au), fie rectangular (60x40x25mm) fie circular (diametru: 60-75mm, înălţime: 20-25mm).
5. Procedură

Se cântăreşte proba cu o marjă de aproximativ 5g (2,5 în cazul produselor ce au tendinţa de a creşte în volum) şi se plasează într-un creuzet pentru calcinare ce iniţial a fost calcinat şi tarat. Se plasează creuzetul pe plita de incalzire şi se încălzeşte treptat până când substanţa se carbonizează. Se pune creuzetul într-un cuptor fixat la 550+5°C. Se menţine la această temperatură până când este obţinută o cenuşă albă, gri deschis sau roşiatică ce pare a fi liberă de particule de cărbune. Se plasează creuzetul într-un exsicator, se lasă să se răcească şi se cântăreşte imediat.
6. Calcularea rezultatelor

Se calculează cantitatea de reziduu scazand tara. Se exprimă rezultatul procentual.
7. Observatii
1. 7.1. Ce' nuşa substanţelor ce sunt dificil de calcinat trebuie
  
  să fie supusă unei calcinări iniţiale de cel puţin trei ore, răcită şi apoi se adaugă la aceasta (cu grijă, pentru a se evita dispersia cenuşii sau formarea de bulgări) câteva picături de soluţie 20% de azotat de amoniu. Se continuă calcinarea după uscare în cuptor. Se repetă operaţiunea cât este necesar, până când este încheiată calcinarea.
2. 7.2. în cazul substantelor rezistente la tratamentul descris în baza punctului 7.1., se p'rocedează după cum urmează: după
  
  o calcinare de trei ore, se plasează cenuşa în apă fierbinte şi se filtrează printr-un filtru mi,c, liber de cenuşă. Se calcinează filtrul şi conţinutul acestuia în creuzetul iniţial. Se plasează filtratul în
  
  creuzetul răcit, se evaporă până la sec, se calcinează şi se cântăreşte.
3. 7.3. În cazul uleiurilor şi al grăsimilor, se cântăreşte cu acurateţe o probă de aproximativ 25 de g într-un creuzet de mărime potrivită. Se carbonizeaza fixând resturile substanţei cu o bucată de hârtie de filtru liberă de cenuşă. După ardere, se umezeşte cu cât de puţină apă este posibil. Se usucă şi se calcinează, aşa cum s-a descris în baza punctului 5.

6. Determinarea cenuşii, insolubilă in acid clorhidric
1. 1. Scop şi domeniu de aplicare
  
  Această metodă face posibil să se determine nivelul de substante minerale ce sunt insolubile în acid clorhidric din
  
  furaje. P'ot fi utilizate două metode, depinzând de natura probei.
  1. 1.1. Metoda A : aplicabilă furajelor organice simple şi majorităţii furajelor combinate
  2. 1.2. Metoda B aplicabilă compuşilor minerali şi amestecurilor şi furajelor combinate al căror conţinut în substanţe insolubile în acid clorhidric, aşa cum s-a determinat prin metoda a, este mai mare de 1%.
2. 2. Principiu
  1. 2.1. Metoda a: proba este calcinată, cenuşa este tratata la cald acid clorhidric si adusa apoi la fierbere, iar reziduul insolubil este filtrat şi cântărit.
  2. 2.2. Metoda b: proba este tratată cu acid clorhidric. Soluţia este filtrată, reziduul calcinat, iar cenuşa astfel obţinută tratată în conformitate cu metoda A.
3. 3. Reactivi
  1. 3.1. Acid clorhidric 3n.
  2. 3.2. 20% (w/v) soluţie de acid tricloracetic.
  3. 3.3. 1% (w/v) soluţie de acid tricloracetic.
4. 4. Aparatură
  1. 4.1. Plita încinsă
  2. 4.2. Cuptor electric cu termostat.
  3. 4.3. Creuzete pentru calcinare din platină sau un aliaj din platină şi aur (10% Pt, 90% Au), fie rectangular (60x40x25mm) fie circular (diametru: 60-75mm, înălţime: 20-25mm).
5. 5. Procedură
  1. 5.1. Metoda A:
    
    Se calcinează proba utilizându-se metoda descrisă pentru determinarea cenuşii brute. Poate fi, de asemenea, utilizată cenuşa obţinută din acea analiză.
    
    Se plasează cenuşa într-un pahar de laborator, utilizându se 75ml de acid clorhidric (3.1). Se aduce încet si se mentine in fierbere inceata timp de 15 minute. Se filtrează soluţia fierbinte printr-o hârtie de filtru liberă de cenuşă şi se spală reziduul cu apă fierbinte până când nu mai este vizibilă reacţia acidă. Se usucă filtrul ce cantine reziduul si cenusa într-un creuzet tarat in prealabil la o temp'eratură de nu mai puţin de 550°C şi nu mai mult de 700°C. Se răceşte într-un exsicator şi se cântăreşte.
  2. 5.2. Metoda B
    
    Se cântăresc 5g din probă cu o aproximaţie de 1mg şi se plasează într-un pahar de laborator de 250-400ml. Se adaugă succesiv 25ml de apă şi 25ml de acid clorhidric 3n (3.1), se amestecă şi se aşteaptă să înceteze efervescenţa. Se adaugă încă 50ml de acid clorhidric 3N (3.1). Se aşteaptă să înceteze orice eliberare de gaz, apoi se plasează paharul de laborator într-o baie cu apă ce fierbe şi acesta se menţine acolo timp de 30 de minute sau mai mult, dacă este necesar, pentru a se hidroliza bine amidonul ce poate fi prezent.
    
    Se filtrează, în timp ce se încălzeşte, printr-un filtru liber de
    
    cenuşă şi se spală filtrul cu 50ml de apă fierbinte (vezi observaţia 7). Se plasează filtrul ce conţine reziduul într-un creuzet pentru calcinare, se usucă şi se calcinează la o temperatură nu mai scăzută de 550°C şi nu mai mult de 700°C. Se plasează cenuşa într-un pahar de 250-400ml, utilizându-se 75ml de acid clorhidric 3n (3.1). Se continuă aşa cum s-a descris la al doilea subparagraf al punctului 5.1.
6. 6. Calcularea rezultatelor
  
  Se calculează cantitatea de cenusa insolubila deducand tara. Se exprimă rezultatul procentual.
7. 7. Observatii
Dacă ' filtrarea se dovedeşte dificilă, se reîncepe analiza,

înlocuind cei 50ml de acid clorhidric 3N (3.1) cu 50ml de acid

tricloracetic (3.2.) şi spălând filtrul într-o soluţie fierbinte de acid tricloracetic (3.3).
7. Determinarea clorului din cloruri

1. Scop şi domeniu de aplicare

Această metodă face posibil să se determine cantitatea de clor din cloruri ce sunt solubile în apă, exprimate convenţional ca şi clorură de sodiu. Aceasta este aplicabilă tuturor furajelor.
2. Principiu

Clorurile prezente in proba de analizat sunt dizolvate în apă. Dacă produsul conţine materie organică, acesta este clarificat. Soluţia este uşor acidifiată cu acid azotic iar clorurile precipită sub formă de clorură de argint, prin intermediul unei soluţii de azotat de argint. Azotatul de argint în exces este titrat cu o soluţie de tiocianat de amoniu, prin metoda Volhard.
3. Reactivi
1. 3.1. Soluţie de tiocianat de amoniu O,1n.
2. 3.2. Soluţie de azotat de argint O,1 n.
  
  l
3. 3.3. Solutie saturată de sulfat feric de amoniu.
4. 3.4. Acid azotic, d20= 1,38g/ml.
5. 3.5. Eter dietilic p.a.
  
  3.6 Acetonă p.a.
4. Aparatură

Mixer (amestecator) avand o frecventa de rotatie de cca.

35-40rpm.
5. Procedură
1. 5.1. Prepararea soluţiei
  
  în conformitate cu natura probei, se prepară o soluţie, aşa cum se specifica la pct. 5.1.1., 5.1.2. sau 5.1.3.
  
  În acelaşi timp se efectuează un test martor ce omite proba ce trebuie analizată.
  1. 5.1.1. Probe libere de materie organică. Se cântăreşte, cu o aproximaţie de 1mg, o proba de lucu de maxim 10g si care se presupune a nu cantine mai mult de 3 g cloruri si se introduce intr-un balon cotat de 500ml cu 400ml apa la temperatura de aproximativ 20°C.Se amestecă timp de 30 de minute în amestecator(4.1), se completeaza la semn cu apa , se omogenizează şi se filtrează.
  2. 5.1.2. Probe ce conţin substante organice, excluzând produsele listate în baza punctului 5.1.3. Se cântăresc cu o precizie de 1mg, o proba de lucru de cca. 5g şi se introduc cu 1 g de carbune activ într-un balon cotat de 500ml. Se adaugă 400ml de apă la aproximativ 20°c şi 5ml de soluţie Carrez I (3.7), se agită şi apoi se adaugă 5ml de soluţie Carrez li (3.8). Se amestecă timp de 30 de minute în amestecatorul (4.1), se completeaza la semn cu apa, se omogenizează şi se filtrează.
  3. 5.1.3. Furaje preparate, sroturi şi făină de in, produse bogate în făină de in şi alte produse bogate în mucilagii sau în substanţe coloidale (de exemplu amidon dextrinizatt).
    
    Se prepară soluţia aşa cum s-a descris la punctul 5.1.2., dar nu se filtrează. Se decantează (dacă este necesar se centrifughează), se reţin 100ml din lichidul supernatant şi se transferă într-un balon cotat de 200ml. Se amestecă cu acetonă (3.6) şi se aduce la volum cu acest solvent, se omogenizează şi se filtrează.
2. 5.2. Titrare
  
  Utilizând o pipetă, se transferă într-un balon Erlenmayer 25-100ml din filtrat (în conformitate cu conţinutul de clor
  
  presupus) obţinut, aşa cum s-a descris în baza punctelor 5.1.1.,
  
  5.1.2 sau 5.1.3. Portiunea alicota nu trebuie să cantină mai mult de 150mg de C'I. Se diluează, dacă este necesa'r, la cel
  
  puţin 50ml cu apă, se adaugă 5ml de acid azotic (3.4), 20ml de soluţie saturată de sulfat feric de amoniu (3.3) şi două picături de soluţie de tiocianat de amoniu (3.1) transferat prin intermediul unui biurete umplută până la semnul zero. Utilizând o biuretă, se transferă oluţia de azotat de argint (3.2) în aşa mod încât este obţinut un exces de 5ml. Se adaugă 5ml de
  
  dietil eter (3.5) şi se agita puternic pentru formarea precipitatului.
  
  Se titrează excesul de azotat de argint cu soluţie de
  
  tiocianat de amoniu (3.1) până la obtinerea unei coloratii roşie brună persistenta timp de 1 minut.
6. Calcularea rezultatelor

Cantitatea de clor (w), exprimată ca şi clorură de sodiu, prezentă în volumul de filtrat luat pentru titrare, este calculată utilizându-se următoarea formulă:

W=5,845(V1 -V2)mg

unde:

V1= ml de soluţie de azotat de argint O,1 N adăugată

V2= ml de soluţie de tiocianat de amoniu O,1 N utilizată pentru titrare.

Dacă testul martor indică faptul că soluţia de azotat de argint O,1 N a fost consumată, se scade această valoare din volumul (V1- V2).
7. Observatii
1. 7.1. T' itrarea poate fi, de asemenea, efectuată prin potenţiometru;
2. 7.2. În cazul produselor ce sunt foarte bogate în uleiuri şi
  
  grăsimi, se realizează o primă degresare cu dietil eter sau eter de petrol
3. 7.3. În cazul făinii de peşte, titrarea poate fi efectuată prin metoda Mohr.
8. Determinarea uleiului de muştar
1. 1. Scop şi domeniu de aplicare
  
  Această metodă face posibil să se determine cantitatea de ulei de muştar conţinut în brichete, elaborate de speciile Brassica şi Sinapis şi din furajele combinate ce conţin brichete obţinute de la aceste specii şi exprimate ca alil izotiacianat ce poate fi antrenat cu aburi.
2. 2. Principiu
  
  Proba este suspendată în apă. Uleiul de muştar este eliberat prin acţiunea enzimelor, antrenat prin distilare cu etanol şi colectat cu amoniac diluat. Soluţia este tratată, în timp ce se
  
  încălzeşte, cu un volum precis de soluţie de azotat de argint, apoi se răceşte şi se filtrează. Excesul de azotat de argint este
  
  titrat cu o solutie de tiocianat de amoniu.
3. 3. Reactivi '
  1. 3.1. Muştar alb (Sinapis alba).
  2. 3.2. Etanol 95-96% (v/v).
  3. 3.3. Emulsie anti-spumă (de ex. silicon).
  4. 3.4. Amoniac, d 20 =958g/ml
  5. 3.5. Soluţie de azotat de argint O,1N.
  6. 3.6. Solutie de tiocianat de amoniu O,1N.
  7. 3.7. Acid 'azotic, d20= 1,4Og/ml
  8. 3.8. Solutie saturată de sulfat feric de amoniu.
4. 4. Aparatură '
  1. 4.1. Balon cotat cu fund plat de 500ml, cu dop rodat de sticlă.
  2. 4.2. Aparat de distilat, echipat cu un refrigerent şI cu echipament pentru prevenirea antrenării picăturilor mici.
5. 5. Procedură
  
  Se cântăresc 1Og de probă cu o aproximaţie de 1mg, se plasează într-un balon cotat cu fundul plat de 500ml şi se adaugă 2g de muştar alb mărunţit fin (3.1) (o sursă de enzimă) şi 200ml de apă la 2O°C.Balonul se menţine la 2O°C timp de aproximativ 2 ore şi se agită frecvent. Se adaugă 40ml de etanol (3.2) şi o picătură de emulsie anti-spumă (3.3). Se distila aproximativ 150ml şi se colectează distilatul într-un pahar ce conţine 20ml de amoniac (3.4), fiind sigur că tubul prelulungitor al refrigerentului este imersat în lichid. Se adaugă la soluţia amoniacală 50ml de soluţie de azotat de argint O,1 N (3.5) (sau mai mult dacă e necesar}, se plasează o mică pâlnie peste pahar şi se încălzeşte amestecul pe o baie de apă fiartă, timp de o oră. Se lasă să se răcească, se completează la semn cu apă, se omogenizeaza şi se filtrează. Se reţin 100ml de filtrat clar, se adaugă 5ml de acid azotic (3.7) şi aproximativ 5ml de
  
  solutie de sulfat feric de amoniu. Se titrează, în schimb, exce'sul de azotat de argint cu o soluţie O,1N de tiocianat de
  
  amoniu (3.6).
  
  Se efectuează un test martor, aplicând aceeaşi procedură la 2g de muştar alb fin, omiţând proba pentru analiză.
6. 6. Calcularea rezultatelor
Se scade volumul de soluţie O,1N de azotat de argint consumat în testul martor din cel consumat de probă în soluţie. Valoarea obtinută redă numărul de ml de solutie O,1N de azotat

de argint co' nsumat de uleiul de muştar din' probă. 1ml de

AgNO3 O,1N corespunde la 4,956 mg de izotiocianat alil. Se exprimă rezultatul procentual.
9. DETERMINAREA LACTOZEI

1. Scop şi domeniu de aplicare

Această metodă face posibil să se determine nivelul de lactoză din furaje ce conţin mai mult de 0,5% lactoză.
2. Principiu

Zaharurile sunt dizolvate în apă. Soluţia este supusă fermentaţiei cu drojdie de Saccharomyces cerevisiae ce lasă lactoza intactă. După clarificare şi filtrare conţinutul de lactoză al filtratului este determinat prin metoda Luff-Schoorl.
3. Reactivi
1. 3.1. Suspensie de Saccharomyces cerevisiae: se suspendă 25g de drojdie proaspătă în 100ml de apă. Suspensia se va ţine pentru o perioadă maximă de o săptămână, într-un frigider.
2. 3.2. Soluţie Carrez I: se dizolvă în apă 21,9 g de acetat de zinc Zn(CH3COO)2 x2H2O şi 3g de acid acetic. Se completează până la 100ml cu apă.
3. 3.3. Soluţie Carrez li: se dizolvă în apă 10,6g de ferocianură de potasiu K4[Fe(CN6) ]x3H2O. Se completează până la 100ml cu apă.
4. 3.4. Reactiv Luff-Schoorl
  
  ln soluţia de carbonat de sodiu(3.4.3) se adaugă soluţie de acid citric (3.4.2) si se agită cu grijă Se adaugă apoi soluţia de sulfat de cupru (3.4.1) şi se completează până la un litru cu apa.. Se lasă in repaus peste noapte şi se filtrează. Se verifica normalitatea reactivului astfel obţinut (Cu O,1N; Na2C03 2N). PH-ul soluţiei trebuie să fie de aproximativ 9,4.
  1. 3.4.1. Soluţie de sulfat de cupru: se dizolvă 25 g de sulfat de cupru p.a. CuSO4 x5H2O, ( fara fier), în 100ml de apă.
  2. 3.4.2. Soluţie de acid citric: se dizolvă 50g de acid citric
    
    p.a C6HaO7 xH2O în 50ml de apă.
  3. 3.4.3. Soluţia de carbonat de sodiu: se dizolvă 143,Bg de carbonat de sodiu anhidru p.a. în aproximativ 300ml de apă calda. Se lasă să se răcească.
5. 3.5. Piatră ponce granulată, fiartă în acid clorhidric, spălată cu apă şi uscată.
6. 3.6. Soluţie 30% de iodură de sodiu (w/v).
7. 3.7. Acid sulfuric 6N.
8. 3.8. Solutie de tiosulfat de sodiu O,1N.
9. 3.9. Solu'ţie de amidon: 5g de amidon solubil dizolvat în
  
  30ml de apă se fierbe într-un litru de apă, timp de trei minute. Se lasă să se răcească şi dacă este necesar, se adaugă 10mg de iodură de mercur ca prezervativ.
4. Aparatură

Baie de apă cu termostat stabilit la 38-40°C.
5. Procedură

Se cântăreşte 1g de probă cu o aproximaţie de 1mg şi se intoduce într-un balon cotat de 100ml. Se adaugă 25-30ml de apă. Se plasează balonul într-o baie de apă la fierbere, timp de

30 de minute dupa care se răceşte la aproximativ 35°C. Se adaugă 5ml de suspensie de drojdie (3.1) şi se omogenizează. Se lasă balonul să stea timp de două ore într-o baie de apă, la o temperatură de 38-40°C. Se lasă să se răcească la aproximativ 20°c.

Se adaugă 2,5 ml de soluţie Carrez I (3.2) şi se agită timp de 30 de secunde, apoi se adaugă 2,5ml de soluţie Carrez li (3.3) şi se agită din nou, timp de 30 de secunde. Se completează până la 100ml cu apă, se omogenizeaza şi se filtrează. Utilizând o pipetă, se reţine o cantitate de filtrat ce nu depăşeşte 25ml şi care conţine de preferinţă 40-80mg de lactoză şi aceasta se transferă într-un pahar Erlenmeyer de 300ml. Dacă este necesar se iau mai putin de 25ml si se completează până la 25ml cu apă.

Se efectuează în acelaşi mod un test martor cu 5ml de suspensie de drojdie. (3.1).

Se determină continutul în lactoză în conformitate cu metoda Luff-Schoorl, du' pă cum urmează: se adaugă exact

25ml de reactiv Luff-Schoorl (3.4) şi două granule de piatră ponce (3.5). Se agită mecanic, în timp ce se încălzeşte deasupra unei flăcări libere, la înălţime medie şi se aduce lichidul la fierbere în aproximativ două minute. Se plasează paharul Erlenmayer pe o sita de azbest cu o gaură de aproximativ 6cm în diametru sub care a fost aprinsă flacăra. Flacăra trebuie să fie reglată în aşa fel incat numai baza Erlenmeyer-ului să fie încălzită. Se ataseaza un refrigerent de reflux la paharul Erlenmeyer. Se fierbe timp de 1O minute. Se răceşte imediat în apă rece şi după aproximativ 5 minute se titrează după cum urmează:

Se adaugă 10ml de soluţie de iodură de potasiu (3.6) şi imediat după aceea (cu grijă, datorită riscului de spumare abundentă) se adaugă 25 ml de acid sulfuric 6N (3.7). Se titrează cu soluţie de tiosulfat de sodiu O ,1N (3.8) până când apare o culoare galbuie, se adaugă solutie de amidon ca indicator (3.9) şi se continua titrarea pana la atingerea virajului.

Se efectuează aceeaşi titrare pe un amestec măsurat cu acurateţe de 25ml de reactiv Luff-Schoorl (3.4) şi 25ml de apă,

după care se adaugă 10ml de iodură de potasiu (3.6) şi 25 ml de acid sulfuric 6N (3.7) fără fierbere.
6. Calcularea rezultatelor

Utilizându-se tabelul ataşat, se stabileşte cantitatea de lactoză, în mg ce corespunde diferenţei dintre rezultatele celor două titrări, exprimată în ml de tiosulfat O,1N.

Se exprimă rezultatul (ca parti de lactoza anhidra) procentual..
7. Observatie

Pentru' produse ce conţin mai mult de 40°/o zahăr

fermentabil, se utilizează mai mult de 5ml de suspensie de drojdie (3.1).

1O. Determinarea potasiului

1. Scop şi domeniu de aplicare

Această metodă face posibil să se determine nivelul de potasiu din furaje.
2. Principiu

Proba este calcinată iar cenuşa dizolvată în acid clorhidric. Conţinutul în sodiu al soluţiei este determinat prin fotometrie cu flacără, în prezenţa clorurii de cesiu şi a azotatului de aluminiu. Adăugarea acestor substanţe elimină în mare măsură interferenţa elementelor perturbatoare.
3. Reactivi
1. 3.1. Acid clorhidric p.a., d= 1,12g/ml.
2. 3.2. Clorură de cesiu p.a
3. 3.3. Azotat de aluminiu Al (NO3)3 x9 H2O, reactiv cu scop general.
4. 3.4. Clorură de potasiu p.a. , anhidra.
5. 3.5. Agent de încărcare: se dizolvă 50 g de clorură de cesiu (3.2) şi 250g de azotat de aluminiu în apă (3.3), se completează până la un litru cu apă şi se omogenizează. Se depozitează în sticle de plastic.
6. 3.6. Soluţie standard de potasiu: se dizolvă 1,907g de clorură de potasiu în apă (3.4), se adaugă 5ml de acid clorhidric (3.1), se completează până la un litru cu apă şi se omogenizează. Se depozitează în sticle de plastic. 1ml al acestei soluţii conţine 1,00mg de potasiu.
4. Aparatură
1. 4.1. Creuzete din platină, siliciu sau porţelan, prevăzute, dacă e necesar, cu capace.
2. 4.2. Cuptor electric cu termostat.
3. 4.3. Flamfotometru

5. Procedură

5.1. Analiza probei

Ca regulă generală, se cântăresc 1O g din probă, cu o aproximaţie de 10mg, se plasează într-un creuzet şi se calcinează la 450°C, timp de trei ore. După răcire se transferă cantitatea de cenuşă într-un balon gradat de 500ml, utilizându se 250-300ml de apă şi se adaugă apoi 50ml de acid clorhidric (3.1). Când a încetat eliberarea de dioxid de carbon, se încălzeşte soluţia şi se menţine temperatura la aproximativ go0c, timp de două ore, agitându-se ocazional. După răcire la

temperatura camerei, se completează până la semnul cu apă, se omogenizeaza şi se filtrează. Se transferă într-un balon gradat de 100ml o portiune alicota din filtratul ce conţine maxim 1,0 mg de potasiu, se adaugă 10,0 ml de agent de încărcare (3.5), se completează până la semnul cu apă şi se omogenizează. În cazul unor cantităţi de potasiu mai mari, se diluează soluţia ce trebuie analizată în proporţii potrivite, înainte de a se adăuga agentul de încărcare.

Tabelul de mai jos e dat ca un ghid pentru o probă de

aproximativ 1Og.

Continut presupus de potasiu din proba(% K)	Factor de dilutie	Parte alicota in ml
pana la 0,1	–	50
0.1 pana la 0.5	–	10
0.5 pana la 1.0	–	5
1.0 pana la 5.0	1:1O	10
5.0 pana la 1O.O	1:10	5
1O.O pana la 20.0	1:20	5

Se măsoară prin fotometrie cu flacără la o lungime de undă de 768nm. Se calculează rezultatul prin intermediul curbei de calibrare.

5.2. Curbă de calibrare

Se plasează exact 10ml de soluţie standard (3.6) într-un balon gradat de 250ml, se completează până la semn cu apă şi se omogenizează. Se plasează în baloane gradate de 100ml exact 5,1O,15, 20 şi 25ml din această soluţie, corespunzând respectiv la cantităţile de potasiu de 0,2, 0,4, 0,6, O, 8 şi 1,0mg/ml. Se completează seriile cu baloane martor ce nu conţine soluţie standard. Se adaugă 1O ml de agent de încărcare (3.5) fiecărui balon, se completează până la semn cu apă şi se omogenizează. Se efectuează măsurătorile, aşa cum s-a indicat la 5.1. Curba de calibrare este în general aliniată la concentraţia de potasiu de 1mg la 100ml de soluţie.

6. Calcularea rezultatelor

Se exprimă rezultatul ca procent din probă.
7. Observatii

Nu es'te întotdeauna necesar să se adauge agentul de

încărcare (3.5) pentru a se elimina interferenţa elementelor perturbatoare.

11. Determinarea sodiului

1. Scop şi domeniu de aplicare

Această metodă face posibil2i determinarea nivelului de sodiu din furaje.
2. Principiu

Proba este calcinată iar cenuşa dizolvată în acid clorhidric. Conţinutul în sodiu al soluţiei este determinat prin fotometrie cu flacără, în prezenţa clorurii de cesiu şi a azotatului de aluminiu. Aditia acestor substante elimină în mare

măsură interferenţa elemen'telor perturbatoare.'
3. Reactivi
1. 3.1. Acid clorhidric p.a., d= 1,12g/ml.
2. 3.2. Clorură de cesiu p.a
3. 3.3. Azotat de aluminiu Al (N03)3 x9 H20, reactiv cu scop general.
4. 3.4. Clorură de potasiu p.a. , anhidra.
5. 3.5. Agent de încărcare: se dizolvă 50 g de clorură de cesiu (3.2) şi 250g de azotat de aluminiu în apă (3.3), se completează până la un litru cu apă şi se omogenizează. Se depozitează în sticle de plastic.
6. 3.6. Soluţie standard de sodiu: se dizolvă în apă 2,542g de clorură de sodiu (3.4), se adaugă 5ml de acid clorhidric (3.1), se completează până la un litru cu apă şi se omogenizează. Se depozitează în sticle de plastic. 1ml din aceste soluţii conţine 1,00mg de sodiu.
4. Aparatură
1. 4.1. Creuzete din platină, siliciu sau porţelan, prevăzute, dacă e necesar, cu capace.
2. 4.2. Cuptor electric cu termostat.
3. 4.3. Flamfotometru

5. Procedură

5.1. Analiza probei

Ca regulă generală se cântăresc 1O g din probă, cu o aproximaţie de 10mg, se plasează într-un creuzet (4.2) şi se calcinează la 450°C timp de trei ore. Se evită supraîncălzirea(aprinderea). După răcire se transferă cantitatea de cenuşă într-un balon gradat de 500ml, utilizându-se 250- 300ml de apă şi se adaugă apoi 50ml de acid clorhidric (3.1). Când a încetat toată eliberarea de dioxid de carbon, se încălzeşte soluţia şi se menţine temperatura la aproximativ 90°C timp de două ore, agitându-se ocazional. După răcire la temperatura camerei, se completează până la semn cu apă, se omogenizeaza şi se filtrează. Se transferă într-un balon gradat de 100ml o portiune alicota din filtrat ce conţine un maxim de 1,0 mg de potasiu, se adaugă 10,0 ml de agent de încărcare (3.5), se completează până la semn cu apă şi se omogenizează. În cazul unor niveluri de sodiu mai mari se diluează soluţia ce trebuie analizată în proporţii potrivite, înainte de a se adăuga agentul de încărcare.

Tabelul de mai jos e redat ca ghid pentru o probă de aproximativ 1Og.

Continut presupus de sodiu din probă (% Na)	Factor de dilut,ie	Parte alicota,tn ml
pana la 0.1	–	50
0.1 până la 0.5	–	10
0.5 până la 1.0	–	5
1.0 până la 5.0	1:10	10
5.0 până la 1O.O	1:10	5
1O.O până la 20.0	1:20	5

Se măsoară intensitatea radiatiei emise la o lungime de undă de 589nm. Se calculează rezultatul prin intermediul curbei de calibrare.

5.2. Curbă de calibrare

Se plasează exact 10ml de soluţie standard (3.6) într-un balon gradat de 250ml, se completează până la semn cu apă

şi se omogenizează. Se plasează în baloane gradate de 100ml exact 5,1O,15,20 şi 25ml din această soluţie, corespunzând respectiv la cantităţi de sodiu de 0,2, 0,4, 0,6, O, 8 şi 1,0mg/ml. Se completează seriile cu balene martor ce nu conţin soluţie standard. Se adaugă 1O ml de agent de încărcare (3.5) fiecărui balon, se completează până la semn cu apă şi se omogenizează. Se efectuează măsurători, aşa cum s-a indicat la 5.1. Curba de calibrare este în general aliniată la concentraţia de sodiu de 1mg la 100ml de soluţie.

6. Calcularea rezultatelor

Se exprimă rezultatul ca procent din probă.
7. Observatii
1. 7.1. Pe' ntru produse ce conţin mai mult de 4% sodiu este
  
  preferabil să se calcineze substanţa timp de două ore într-un creuzet cu capac. După răcire se adaugă apă, se aduce apa în suspensie prin intermediul unui fir de platină, se usucă şi se calcinează din nou, timp de două ore, într-un creuzet cu capac.
2. 7.2. Dacă proba constă numai din substanţe minerale, se dizolvă fără o calcinare prealabilă.

12. Determinarea zahărului

1. Scop şi domeniu de aplicare

Această metodă face posibil să se determine cantitatea de zaharuri reduse şi toate zaharurile după inversie, exprimată ca glucoză sau când este cazul ca sucroză, convertită de factorul 0,95. Această metodă este aplicabilă furajelor combinate. Sunt prevăzute metode speciale pentru alte furaje. Când este necesar, trebuie să fie măsurată separat lactoza şi trebuie să se tină cont de aceasta atunci când se calculează rezultatele.
2. P' rincipiul

Extractia zaharurilor dintr-o probă cu un amestec.Clarificarea solutiei obtinute cu solutiile Carrez I si li.Separarea etanolului si determinarea zaharurilor cu reactiv Luff-Schoorl înainte si dupa invertire .
3. Reactivi
1. 3.1. Etanol 40% (v/v) d20 =0,948g/ml neutralizat m
  
  prezenta de fenolftaleină:
2. 3.2. Soluţie Carrez I: se dizolvă 21,9g de acetat de zinc Zn(CH3COO)2.2H2O şi 3g de acid acetic glacial în apă. Se completează până la 100ml cu apă.
3. 3.3. Soluţie Carrez li: se dizolvă 10,6g de ferocianură de potasiu K4Fe(CN6), 3H2O în apă. Se completează până la 100ml cu apă.
4. 3.4. Soluţie O,1% (w/v) de metil oranj.
5. 3.5. Acid clorhidric 4n.
6. 3.6. Acid clorhidric O,1n.
7. 3.7. Solutie de hidroxid de sodiu O,1n.
8. 3.8. Reac'tiv Luff-Schoorl
  1. 3.8.1 Soluţie de cupru: se dizolvă 25g de sulfat de cupru
    
    p.a CuSO4x 5H2O (fara) fier, în 100ml de apă.
  2. 3.8.2 Soluţie de acid citric: se dizolvă 50g de acid citric A.R., C6HaO7xH2O în 50ml de apă.
  3. 3.8.3 Soluţie de carbonat de sodiu: se dizolvă 143,8g de
    
    carbonat de sodiu anhidru p.a. în aproximativ 300ml de apă calda. Se lasă sa se raceasca.
    
    Amestecand cu atentie, se pune soluţia de acid citric (3.8.2) peste soluţia de carbonat de sodiu (3.8.3). Se adaugă soluţia de sulfat de cupru (3.8.1) şi se completează până la un litru cu apă. Se lasă in repaus peste noapte şi apoi se filtrează. Se verifica normalitatea reactivului astfel obţinut (Cu O,1 N;Na2CO3 2N). PH-ul soluţiei trebuie să fie de aproximativ 9,4.Se lasa sa se raceasca.
9. 3.9. Soluţie de tiosulfat de sodiu O,1n.
  
  3.1O. Soluţie de amidon: Sg de amidon solubil dizolvat în 30ml de apă se fierb intr-un litru de apa, trei minute, se lasă să se răcească şi dacă e necesar, se adaugă 10mg de iodură de mercur ca prezervativ.
4. Aparatură

Mixer(agitator) cu f ecvenţă rotatorie de 35-40 rpm.
5. Procedură
1. 5.1. Extracţia probei
  
  Se cântăresc 2,5g din probă cu o aproximaţie de 1mg şi se introduc într-un balon cotat de 250ml. Se adaugă 200ml de etanol (3.1) şi se agita mecanic timp de o oră. Se adaugă 5ml de soluţie Carrez I (3.2) şi se agită timp de un minut apoi se mai adaugă 5ml de soluţie Carrez li (3.3) agitand din nou, timp de 1 minut. Se completează la volum cu etanol (3.1), se omogenizează şi se filtrează. Se reţin 200ml din filtrat şi se evaporă la aproximativ jumătate din volum, pentru a se elimina majoritatea etanolului. Se transferă întreaga cantitate din reziduul de evaporare într-un balon cotat de 200ml, utilizându se apă fierbinte, se răceşte, se aduce la volum cu apă, se omogenizează şi se filtrează, dacă este necesar. Această soluţie va fi utilizată pentru a se determina cantitatea de zaharuri reduse şi după invertire, a zaharului total.
2. 5.2. Determinarea zaharurilor reducatoare
  
  Utilizându-se o pipetă, se ia o cota parte din filtrat(5.1) sa nu depaseasca 25ml de soluţie si care sa nu conţin mai puţin de 60mg de zaharuri reduse, exprimate ca glucoză. Dacă e necesar se iau mai putin de 25ml si se completează până la 25ml cu apă distilată şi se determină conţinutul de zaharuri reduse prin metoda Luff-Schoorl. Rezultatul este exprimat ca procent al glucozei din probă.
3. 5.3. Determinarea zaharurilor totale după invertire
  
  Utilizându-se o pipetă, se iau 50ml de soluţie şi se transferă într-un balon cotat de 100ml. Se adaugă câteva picături de soluţie de metil oranj (3.4) apoi, cu grijă şi agitând continuu, se adaugă acid clorhidric 4N (3.5), până când lichidul virează spre un roşu accentuat. Se adaugă 15ml de acid clorhidric O,1 N (3.6), se imersează rapid balonul într-o baie de apă la fierbere şi se ţine acolo timp de 30 de minute. Se răceşte rapid la aproximativ 20°c şi se adaugă 15ml de soluţie de hidroxid de sodiu O,1n. Se completează apoi până la 100ml cu apă şi se omogenizează. Se reţin cel mult 25ml ce conţin mai puţin de 60mg de zaharuri reduse exprimate ca glucoză. Dacă e necesar se iau mai putin de 25ml si se completează până la 25ml cu apă distilată şi se determină conţinutul de zaharuri
  
  reduse prin metoda Luff-Schoorl. Rezultatul este exprimat ca procent de glucoză sau, unde e cazul, sucroză, multiplicându se cu factorul 0,95.
4. 5.4. Titrare prin metoda Luff-Schoorl
  
  Utilizându-se o pipetă, se iau 25ml de reactiv Luff-Schoorl (3.8) şi se transferă într-un pahar Erlenmeyer de 300ml.Se adaugă 25ml de soluţia clarificată de zahăr. Se adaugă 2 granule de piatră ponce (3.13), se încălzeşte, se agită manual deasupra unei flăcări libere la înălţime medie şi se aduce lichidul la fierbere în aproximativ două minute. Se instaleaza imediat balonul Erlenmeyer pe o sita azbest, cu o gaură de aproximativ 6cm în diametru, sub care a fost aprinsă o flacără. Flacăra va fi reglată în aşa fel ca numai baza balonului Erlenmeyer să fie încălzită. Se ataşează un refrigerent de reflux la paharul Erlenmeyer. Se fierbe timp de exact 1O minute. Se răceşte imediat în apă rece iar după aproximativ cinci minute se titrează după cum urmează:
  
  Se adaugă 10ml de soluţie iodată de potasiu (3.12) şi imediat după aceea (cu grijă, datorită riscului de spumare abundentă), se adaugă 25ml de acid sulfuric 6n (3.11). Se titrează cu o soluţie de tiosulfat de sodiu O,1n (3.9) până când apare o culoare galbuie, se adaugă solutie de amidon (3.1O) şi se finalizează titrareapana la atingerea virajului.
  
  Se efectuează aceeaşi titrare pe un amestec măsurat cu acurateţe de 25ml de reactiv Luff-Schoorl (3.8) şi 25ml de apă, după ce se adaugă 10ml de soluţie de iodură de potasiu (3.12) şi 25ml de acid sulfuric 6n (3.11), fără fierbere si se titrează identic
6. Calcularea rezultatelor

Utilizând tabelul de mai Jos se stabileşte cantitatea de glucoză în mg ce corespunde diferenţei dintre valorile celor două titrări, exprimată în mg de tiosulfat de sodiu O,1n; rezultatele se exprima procentuală
7. Proceduri speciale
1. 7.1. În cazul furajelor ce sunt bogate în melasă şi alte furaje ce nu sunt în particular omogene, se cântăresc 20g şi se trec cu 500ml de apă într-un balon cotat de un litru. Se agita timp de o oră apoi se clarifică utilizând reactivii Carrez I (3.2) şi
  
  li (3.3), aşa cum s-a descris la punctul 5.1. utilizându-se totuşi, de data aceasta, de patru ori cantităţile din fiecare reactiv. Se aduce la volum cu etanol 80% (v/v).Se omogenizează şi se filtrează. Se elimină etanolul, aşa cum s-a descris la punctul
  
  5.1. Dacă nu există amidon dextrinizat, se aduce la volum cu apă distilată.
2. 7.2. În cazul melasei şi al subproduselor ce sunt bogate în zahăr şi aproape libere de amidon (roşcove, brichete de sfeclă etc.), se cântăresc 5g, se trec într-un balon cotat de 250ml, se adaugă 200ml de apă distilată şi se agita timp de o oră sau mai mult, dacă e necesar. Se clarifică utilizând reactivii Carrez I (3.2) şi li (3.3) aşa cum s-a descris la punctul 5.1. Se aduce la volum cu apă rece, se omogenizează şi se filtrează. Se continuă aşa cum s-a descris la punctul 5.3., pentru a se determina cantitatea de zaharuri totale.
8. Observatii
1. 8.1. Pe' ntru a se preveni spumarea este recomandabil să
  
  se adauge (indiferent de volum) aproximativ 1ml de 3- metilbutan-I-ol (3.14) înainte de fierbere cu reactiv Luff-Schoorl.
2. 8.2. Diferenţa dintre conţinutul total de zahar după invertire, exprimat ca glucoză şi conţinutul de zaharuri reducatoare, exprimat ca glucoză, multiplicat cu 0,95, redă conţinutul procentual de sucroză.
3. 8.3. Pentru a se determina continutul de zaharuri reducatoare, excluzând lactoza, două metod' e pot fi adoptate:

8.3.1. Pentru o calculare aproximativă, se multiplică cu 0,675 conţinutul de lactoză stabilit printr-o oarecare metodă de analiză şi se scade rezultatul obţinut din conţinutul zaharurilor reducatoare

8.3.2. Pentru o calculare precisă a zaharurilor reducatoare,

excluzând lactoza, aceeaşi probă trebuie să fie utilizată pentru cele două determinări finale. Una din analize este efectuată pe o parte din soluţia obţinută la punctul 5.1., cealaltă pe partea soluţiei obţinute în timpul determinării lactozei de metoda stabilită pentru acel scop (după fermentarea celorlalte tipuri de zaharuri şi clarificare).

În ambele cazuri cantitatea de zahăr prezentă este determinată prin metoda Luff-Schoorl şi calculată în mg de

glucoză. Una din valori este scăzută din cealaltă, iar diferenţa este exprimată procentual.

Exemplu:

Cele două volume preluate corespund, pentru fiecare determinare, la o probă de 250mg.

În primul caz sunt consumaţi 17ml de soluţie de tiosulfat

de sodiu O,1N, corespunzând la 44,2mg de glucoză.

În al doilea caz sunt consumaţi 11ml, corespunzând la 27,6mg de glucoză.

Diferenţa este de 16,6mg de glucoză.

Conţinutul de zahar reducator (excluzând lactoza), calculat ca glucoză, este:

4×16,6 = 6,64%

Tabel de valori pentru 25ml de reactiv Luff-Schoorl

ml de Na2S203 O,1N, 2 minute de încălzire, 1O minute de fierbere

Na2 S2 Os Glucoză, fructoză zahar invertit

0,1N ml	mg	C5H1206 diferentă	mg	diferenţă	mg	diferent,ă	0,1N ml
1	2.4	2.4 '	3.6	3.7	3.9	3.9	1
2	4.8	2.4	7.3	3.7	7.8	3.9	2
3	7.2	2.5	11.0	3.7	11.7	3.9	3
4	9.7	2.5	14.7	3.7	15.6	4.0	4
5	12.2	2.5	18.4	3.7	19.6	3.9	5
6	14.7	2.5	22.1	3.7	23.5	4.0	6
7	17.2	2.6	25.8	3.7	27.5	4.0	7
8	19.8	2.6	29.5	3.7	31.5	4.0	8
9	22.4	2.6	33.2	3.8	35.5	4.0	9
10	25.0	2.6	37.0	3.8	39.5	4.0	10
11	27.6	2.7	40.8	3.8	43.5	4.0	11
12	30.3	2.7	44.6	3.8	47.5	4.1	12
13	33.0	2.7	48.4	3.8	51.6	4.1	13
14	35.7	2.8	52.2	3.8	55.7	4.1	14
15	38.5	2.8	56.1	3.9	59.8	4.1	15
16	41.3	2.9	59.9	3.9	63.9	4.1	16
17	44.2	2.9	63.8	3.9	68.0	4.2	17
18	47.1	2.9	67.7	4.0	72.2	4.3	18
19	50.0	3.0	7.1.7	4.0	76.5	4.4	19
20	53.0	3.0	75.7	4.1	80.9	4.5	20

21	56.0	3.1	79.8	4.1	85.4	4.6	21
22	59.1	3.1	83.9	4.1	9Q.O	4.6	22
23	62.2		88.0		94.6		23

14. Determinarea ureei
1. 1. Scop şi domeniu de aplicare
  
  Această metodă face posibil determinarea nivelului de uree din furaje.
2. 2. Principiu
  
  Proba este suspendată în apă cu un agent de de clarificare. Suspensia este filtrată. Conţinutul de uree al filtratului este determinat după adăugarea a 4- dimetilaminobenzaldehidă (4-DMAB), măsurând densitatea optică la o lungime de undă de 420nm.
3. 3. Reactivi
  
  3.1. Solutie de 4-dimetilaminobenzaldehidă: de dizolvă 1,6g de 4-DMA' B p.a. în 100ml de etanol 96°/o şi se adaugă
  
  10ml de acid clorhidric p.a.. (d20=1,19g/ml). Acest reactiv poate fi folosit pentru o perioadă de maximum două săptămâni.
  
  3.2. Soluţie Carrez I: se dizolvă 21,9g de acetat de zinc, Zn (CH3C00)2x 2H20 şi 3g de acid acetic glacial în apă. Se completează până la 100ml cu apă.
  
  3.3. Soluţie Carrez li: se dizolvă 10,6g de ferocianură de potasiu în apă, K4Fe(CN)6, 3H20. Se completează până la 100ml cu apă.
  
  3.4. Carbune activ p.a. ce nu absoarbe uree (ce trebuie controlată).
4. 4. Aparatură
  1. 4.1. Mixer (agitator) cu frecventa rotatorie de aproximativ 35-4Orpm.
  2. 4.2. Eprubete: 16Ox 16mm cu dop rodat de sticlă.
  3. 4.3. Spectrofotometru.
5. 5. Procedură
  1. 5.1. Analiza probei
    
    Se cântăresc 2g de probă cu o aproximaţie de 1mg şi se introduc cu 1g carbune activ (3.4) într-un ·balon cotat de 500ml. Se adaugă 400ml de apă şi 5ml de soluţii Carrez I (3.2) şi 11 (3.3). Amestecul se agita timp de 30 de minute cu ajutorul agitatorului rotativ. Se completează la semn cu apă, se agită şi se filtrează.
    
    Din filtratul clar si incolor se iau 5ml si se introduc înt-o eprubeta cu dop slefuit. Se adaugă 5ml de soluţie 4-DMAB (3.1) şi se omogenizeaza. Se pregateste in paralel o solutie martor, procedand conform pct. 5.1 Se introduc eprubetele cu solutia de analizat si respectiv cu solutia martor într-o baie de apă si se mentin 15 minute la 20°c. Apoi se măsoară extinctia solutiei de analizat in raport cu solutia martor, la lungimea de unda de 420nm. Se citeste pe curba de etalonare continutul de uree corespunzator extinctiei masurate.
  2. 5.2. Curba de calibrare
    
    Se reţin volume a 1,2,4,5 şi 10ml de soluţie de uree (3.5), se introduc în baloane cotate de 100ml şi se completează la semn cu apă. Se iau cate 5ml din fiecare balon, in eprubete cu dop slefuit. Se adaugă cate 5ml de soluţie 4-DMAB (3.1) în fiecare din acestea si se omogenizeaza.Se introduc eprubetele într-o baie de apa si se mentin timp de 15minute la 20°c .Se masoara extinctia acestor solutii la lungimea de unda de 420nm, in raport cu o soluţie martor constituita din 5ml de 4- dmab şi 5ml de apă liberă de uree. Se traseaza curba de etalonare.
6. 6. Calcularea rezultatelor
  
  Se determină cantitatea de uree din probă, utilizându-se curba de calibrare.
  
  Se exprimă rezultatul precentual.
7. 7. Observa–tii
  1. 7.1. ln' cazul cantităţilor de uree ce depăşesc 3%, se
    
    reduce proba la 1g sau se diluează soluţia iniţială, astfel încât să nu existe mai mult de 50 de mg de uree în 500ml.
  2. 7.2. în cazul cantităţilor scăzute de uree, se măreşte
    
    proba atât timp cât filtratul rămâne clar si incolor..
  3. 7.3. Dacă proba conţine compuşi azotaţi simpli, precum aminoacizi, densitatea optică trebuie să fie măsurată la 435nm.
15. Estimarea activităţii ureazice a produselor derivate din soia

1. Scop şi domeniu de aplicare

Acest test face posibilă estimarea activităţii ureazice a produselor derivate din soia şi arată dacă aceste produse au fost preparate suficient de mult timp.
2. Principiu

Activitatea ureazică este estin,ată prin cantitatea de azot amoniacal eliberată de 'Ig de produs per minut, la 30°C.
3. Reactivi
1. 3.1. Acid clorhidric O,1N.
2. 3.2. Solutie de hidroxid de sodiu O,1n.
3. 3.3. Solu'tie tampon de fosfati: se dizolva 4,45g fosfat
  
  disodic(Na2HPO4x2H2O) si 3,40g fosfat monopotasic(KH2PO4 x 2H2O) in apa; s:e completeaza cu apa la 1000ml.
4. 3.4. Uree ,solutie cu pH 6,9-7,0: se dizolva 30g uree in 1000ml solutie tampon de fosfati.
4. Aparatură
1. 4.1. Aparat ele titrare potenţiometrică sau pH-metru de înaltă sensibilitate (pH 0,02) cu agitator magnetic.
2. 4.2. Baie de apă echipată cu termostat stabilit la exact 30°c.
3. 4.3. Eprubete de 150x18mrn cu dop slefuit.
4. 4.4. Sita cu dimensiunea ochiurilor de 0,2mm
5. 4.5. Moara de laborator,usor de curatat si care permite macinarea fara a provoca incalzirea produsului
5. Procedură

Se mărunţ:esc aproximativ 10g de probă (de exemplu într o râşniţ:ă de cafea), astfel ca aceasta să treacă printr-o sită cu ochiuri de 0,2rnm. Se cântăresc 0,2g din proba mărunţită cu o aproximaţie de 1mg, se introduc într-o E prubetă cu dop rodat de sticlă şi se adau lă 1On1I de solutie de uree (3.4). Se astupa imediat şi se agit i cu vigoare. Se introduce eprubeta într-o baie de apă fixată exact la 30°C şi se agitii cu vigoare. Se adaugă imediat 10ml de acid clorhidric (3.1), se răceşte rapid la 20°c şi

se transvazeaza cantitativ conţinutul eprubetei într-un vas de titrare, clătindu-se de două ori cu 5ml de· apă. Utilizându-se un electrod de sticlă (4.1), se titrează imediat şi rapid la pH 4,7 cu soluţie de hidroxid de sodiu O,1N .

Se efectuează o determinare martor după cum urmează: se introduce repede o probă de 0,2g cântărită cu o aproximaţie de 1mg într-o eprubetă cu dop rodat de sticlă, se adaugă 10ml de acid clorhidric O,1n (3.1) şi apoi 10ml solutie de uree (3.4). Se răceşte eprubeta imediat în apă cu gheaţă şi se lasă acolo timp de 30 de minute. Se aduce apoi la temperatura de 20°c se transfera cantitativ conţinutul eprubetei în paharul in care se face titrarea.Se titreaza imediat si repede cu hidroxid de sodiu solutie O,1 npana la pH 4,7 .
6. Calcul:

Activitatea ureazica se calculeaza cu formula:

1,4 X (a-b)

[ mg N/gxmin la 30 °c ]
30x E

unde

a = volumul solutiei de hidroxid de sodiu O,1n folosit la titrarea probei de analizat, in ml

b = volumul solutiei de hidroxid de sodiu O,1n folosit la titrare la determinarea martorului, in ml

1,4 = cantitatea de azot corespunzatoare la 1ml, hidroxid de sodiu O,1 n

30 durata tratarii probei cu solutie de uree,in minute
7. Observatii:
1. 7.1. Aceasta metoda este aplicabila pentru activitate ureazica peste 1 mg de N/g/min. la 30 °C.Pentru produse cu acivitate ureazica mai mare , cantitatea de proba poate fi redusa la 50mg.
2. 7.2. Produsele cu continut de grasime mai mare de 10% trebuie in prealabil degresate.

AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR

O R D I N

pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conținutul în avoparcină și monenzin de sodiu*)

Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia,

văzând Referatul de aprobare nr. 153.453 din 27 mai 2004 al Direcției generale veterinare,

președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin:

Art. 1. — Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conținutul în avoparcină și monenzin de sodiu, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art. 2. — Institutele centrale de profil, direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a

municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Art. 3. — Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin.

Art. 4. — Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor,

Liviu Harbuz

București, 10 iunie 2004.

Nr. 19.

*) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 19/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis.

**) Anexa este reprodusă în facsimil.

ANEXĂ

NORMĂ VETERINARĂ

ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conținutul în avoparcină și monenzin de sodiu

ANEXĂ

la norma veterinară

apă.

Extract de drojdie de bere·.3,0 g Extract de carne 1.5 g Glucoză:1,0 g

Agar 15,0 g

Apă 1000 ml

pH:6,5 (după sterilizare).

4.2. Etanol 20% (v/v): se diluează 200 ml etanol cu 800 ml
4.3. Acid clorhidric, d: 1,18 – 1,19.
4.4. Hidroxid de sodiu, solutie 2 M
4.5. Tampon fosfat, O,1 M: _'

Fosfat dihidrogenat de potasiu, KH2 04: 13,6 gă Apă până la 1OOO ml.

Se aduce pH-ul la 4.5.
4.6. Amestec de acetonă/apă/acid clorhidric (4.3):

65/32.5/2.5 (v/v/v).
4.7. Substanţă standard: avoparcină de activitate cunoscută.

5. Solut,ii etalon

Se dizolvă o cantitate precis cântărită de 1O mg din

°

substanţa standard (1-7) în tampon fosfat (4.5) şi se diluează cu acest tampon pentru a se obţine soluţia stoc ce conţine 100 µg avoparicină/ml. Se păstrează în flacoane închise la 4 C, această soluţie este stabilă timp de maxim şapte zile.
1. 5.1. Pentru premixuri
  
  Din această soluţie stoc se prepară prin diluţie succesivă cu ajutorul tamponului, (4.5) următoarele soluţii:
  
  Sa 4.0 µg/ml
  
  S4 2.0 µg/ml
  
  S2 1.0 µg/ml
  
  S1 0.5 µg/ml
2. 5.2. Pentru furaje
  
  Din soluţia stoc se prepară prin dilutie succesivă cu ajutorul tamponului, (4.5) următoarele soluţii
  
  Sa 2.0 µg/ml
  
  S4 1.0 µg/ml
  
  S2 0.5 µg/ml
  
  S1 0.25 µg/ml

6. Prepararea soluţiilor de extract şi de probă

6.1. Premixuri

Se cântăreşte cu o precizie de 1O mg, o cantitate suficientă de probă ce conţine 10,0 până la100 mg avoparcină. Se transferă într-un balon cotat de 100 ml cu 60 ml amestec (4.6) şi se agită timp de 15 minute pe agitatorul mecanic Se controlează pH-ul şi se aduce la pH 2 cu acid clorhidric, dacă este necesar (4.3). Se aduce la volum cu amestecul (4.6) şi se omogenizează. O parte se filtrează printr-o hârtie de filtru potrivită (ex. Whatman nr. 1), se elimină primii 5 ml de filtrat. Se ia o parte alicotă şi se aduce pH-ul la 5.4 cu soluţie de hidroxid de sodiu (4.4). Se diluează această soluţie cu tampon (4.5) pentru a se obţine o concentraţie dorită de avoparicină de 4.0 µg/ml ( = U8)

Pentru această soluţie se prepară soluţiile U4 (conţinut evaluat: 2.0 µg/ml), U2 (conţinut evaluat: 1.0 µg/ml) şi U1 (conţinut evaluat: 0.5 µg/ml) prin diluţie succesivă (1+1) cu tampon (4.5).

6.2. Furaje

Se cântăreşte o cantitate de probă de 50 g şi se agită 100 ml din amestec (4.6) timp de 30 minute pe agitatorul mecanic. Se clarifică extractul prin centrifugare (utilizând tuburi de centrifugă acoperite cu dopuri), se ia o parte alicotă de extract clarificat (vezi tabelul de mai jos) şi se aduce pH-ul la 4.5, fU soluţie de hidroxid de sodiu (4.4). Se diluează această parte alicotă cu tampon (4.5) pentru a se obţine U8 (vezi tabelul de mai jos)

Pentru această soluţie se prepară soluţiile U4 (conţinut evaluat: 1 µg/ml), U2 (conţinut evaluat: 0.5 µg/ml) şi U1 (conţinut evaluat: 0.25 µg/ml) prin diluţie succesivă (1+1) cu tampon (4.5).

Nivel presupus de avoparcină (mg/kg)

7.5

Masa probei (g +0.1

Volumul amestecului (4.6) (ml)

100

Volumul extractului clarificat (ml)

Volum final (ml): Ua

100

Concentratia dorită Ua

µg/ml '

aprox.2

7. Procedura de testare
1. 7.1. Însământarea mediului de testare
  
  Se însămânţe' ază mediul de testare (4.1) cu suspensie de spori (3.2) la 50 – 60 °c. Prin experimente preliminare pe plăci cu mediu de testare (4.1) se determină cantitatea de suspensie
  
  de spori necesară pentru a se determina cele mai întinse şi mai clare zone de inhibiţie cu diferite concentraţii de avoparcină.
2. 7.2. Prepararea plăcilor de însămânţare
  
  Difuzia pe agar este efectuată în plăci utilizâdu-se patru concentraţii din soluţia etalon (S8 S4 S2 S1) şi patru concentraţii din soluţia probei (Ua, U4,U2, U1). Aceste patru concentraţii ale extractului şi ale etalonului trebuie, în mod necesar, să fie
  
  plasate în fiecare placă. în acest scop, se aleg plăci destul de mari pentru a se permite să fie realizate în mediu de agar cel puţin opt godeuri cu un diametru de 1O până la 13 mm şi la nu mai puţin de 30 mm între centre. Testul poate fi efectuat pe plăci formate dintr-o placă de sticlă cu o faţă din aluminiu sau un inel din plastic plasat în vârf, 200 mm în diametru şi 20 mm înăltime.
  
  ' Se toarnă în plăci o cantitate din mediul (4.1) însămânţat
  
  cum este indicat la punctul 7.1., pentru a se obţine un strat de aproximativ 2 mm grosime (60 ml pentru o placă de 200 mm diametru). Se lasă să se solidifice, se realizează godeuri şi se pun în acestea volume de probă exact măsurate şi soluţii standard (între O,1O şi O,15 ml/godeu, conform diametrului). Se utilizează fiecare concentraţie de cel puţin patru ori astfel încât fiecare determinare să fie supusă unei evaluări a 32 zone de inhibitie.
  
  7' .3. lncubatie
  
  Se incubea ă plăcile timp de 16 – 18 ore, la 30 °C.
8. Evaluare

a) SL= 1s1 +4s2 +S4-2S8

10

Se determină punctul ăcel mai potrivit" pentru nivelul standard cel mai ridicat (SH) utilizând formula:

(b)

SH =

7Sa +4S4 +S2 -2S1

10

Se calculează în mod similar punctele ăcele mai potrivite" pentru nivelul cel mai scăzut de extract (UL) şi nivelul cel mai înalt de extract (UH) prin substituirea U1,U4 şi Ua cu S1, S2 şi S8 din formula mentionată mai sus.

Se înregist'rează valorile calculate ale SL şi SH, pe aceeaşi hârtie grafică şi se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită” pentru soluţia etalon. Se înregistrează în mod similar UL şi UH şi se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită” pentru extract.

În absenta oricărei interferente liniile trebuie să fie paralele. Pentr'u scopuri practice l'iniile pot fi considerate paralele dacă valorile (SH-SL) şi (UH-UL) nu diferă mai mult de 10% ca valoare medie a acestora.

Dacă liniile nu sunt paralele fie U1 şi S1 fie U8 şi S8 pot fi eliminate şi SL, SH, UL şi UH calculate, utilizând formula alternativă, pentru a da liniile alternative ăcele mai potrivite”.

(a') SL= 5S1+ 2S2-2S4sau 5S2+ 2S4-Sg

6 6

(b') ss = ss4 +2s2-s1 sau 5S8 +2s4-s2

6 6

şi în mod similar pentru UL şi UH. Trebuie să fie respectate aceleaşi criterii de paralelism. Faptul că rezultatul a fost calculat pe baza celor trei nivele trebuie să fie notat în raportul final.

Atunci când liniile sunt considerate ca fiind paralele, se calculează logaritmul activităţii relative (log A) prin intermediul uneia din următoarele formule:

Pentru patru nivele
1. (c) LogA= (Ul +U2+U4+Ug -Sl -S2 -S4-Sg)X0,602 U4+Ug+S4+Sg-Ul -U2 -Sl -S2
  
  Pentru patru nivele
2. (d) LogA= (Ul +U2 +U4-sl -S-S24)X0,401
U4 +S4 -Ul,-Sl

sau

(d') LogA= (U2 +U4 +U8 -S2 -S4 -S8)X0,401

U8+S8-U2-S2

Activitate reală – activitate presupusă x activitate relativă Dacă activitatea relativă este în afara gamei de valori

cuprinse între 0,5 şi 2,0, atunci se repetă proba făcând ajustări corespunzătore ale concentraţiilor extractului sau dacă aceasta nu este posibil, ale soluţiilor etalon. Atunci când activitatea relativă nu poate fi adusă în gama de valori solicitată, orice rezultat obţinut trebuie să fie considerat ca aproximativ şi acesta trebuie notat în raportul final.

Atunci când liniile sunt considerate ca nefiind paralele, se repetă determinarea. Dacă paralelismul nu este totuşi realizat,

înseamnă că nu a fost obtinută o determinare satisfăcătoare.
9. Repetabilitate '

Diferenţa între rezultatele celor două determinări paralele, efectuate pe aceleaşi probă prin aceeaşi analiză, nu trebuie să depăşească

– 2 mg/kg, în valoare absolută, pentru niveluri de avoparcină până la 1O mg/kg,
– 20% în raport cu valoarea cea mai mare pentru niveluri de la 1O până la 25 mg/kg,
– 5 mg/kg, în valoare absolută, pentru niveluri de la 25 până la 50 mg/kg,
– 10% în raport cu valoarea cea mai mare pentru niveluri mai mari de 50 mg/kg.

2. Determinarea monenzinului de sodiu prin difuzie in mediu de agar

1. Scop şi aplicabilitate

Această metodă are ca scop determinarea monenzinului de sodiu din furaje şi premixuri. Limita minimă a determinării este de 1O mg/kg (1O ppm).(3)
2. Principiu

Proba este extrasă cu 90°/c> metanol. Extractul este supus procedurilor corespunzătoare conform cu conţinutul probei în monenzin de sodiu. Activitatea antibiotică a acestuia este determinată prin măsurarea difuziei monenzinului de sodiu într un mediu de agar însămânţat cu Bacillus subtilis. Difuzia este

relevată prin formarea zonelor de inhibiţie a microorganismului. Diametrul acestor zone este considerat a fi direct proporţional cu logaritmul concentraţiei de antibiotic peste gama concentratiilor de antibiotic utilizate. Sensibilitatea acestui

sistem de 'testare este redusă în prezenţa sodiului.
3. Microorganism: Bacillus subtilis attc 6633 (ncib 8054)
1. 3.1. întretinerea culturii stoc
  
  Se însăm' ântează mediul de cultură în tuburi înclinate
  
  (4.1), cu Bacillus ubtilis şi se incubează peste noapte la 30 °C. Cultura se păstrează la frigider la 4 ° C. Se reînsămânţează
  
  lunar.
2. 3.2. Prepararea suspensiei de spori C)
  
  °
  
  °
  
  Se recoltează o cultură crescută pe agar înclinat preparat recent, (3.1) cu 2-3 ml apă sterilă. Această suspensie se utilizează la însămânţarea a 300 ml mediu de cultură (4.1) conţinut într-un flacon tip Roux şi se incubează timp de 3 – 5 zile la 30 C. Cultura se recoltează în 15 ml etanol 20% (4.3), după ce se controlează sporularea la microscop .şi se omogenizează. Această suspensie poate fi menţinută timp de cel puţin 5 luni, la aproximativ la 4 C.
4. Mediu de cultură şi reactivi
1. 4.1. Mediu de cultură (2)
  
  Triptona 10,0 g
  
  Extract de drojdie de bere Extract de carne
  
  1.5 g
  
  3,0 g
  
  Glucoză 1,0 g
  
  Agar (conform cu calitatea) 10,0 – 20,0 g Apă 1000 ml
  
  pH 6,5(după sterilizare).
2. 4.2. Mediul probei
  
  Glucoză
  
  Extract de drojdie de bere
  
  Fosfat hidrogenat de potasiu, K2HPO4 Fosfat dihidrogenat de potasiu, KH2 PO4
  
  10,0 g
  
  2,5 g
  
  0,69g
  
  0,45 g
  
  Agar (conform cu calitatea)
  
  Apă
  
  pH 6 (după sterilizare).
  
  10,0 – 20,0 g
  
  1000 ml
  
  apă.
3. 4.3. Etanol 20% (v/v): se diluează 200 ml etanol cu 800 ml
4. 4.4. Metanol anhidru
5. 4.5. Metanol 90% (v/v): se diluează 900 ml metanol (4.4)
  
  cu 100 ml apă
6. 4.6. Metanol 50% (v/v): se diluează 500 ml metanol (4.4) cu 500 ml apă
7. 4.7. Oxid de aluminiu granulat (Aicea F, 20 mesh Alumină activată UG 1)
8. 4.8. Substantă standard Monenzin de sodiu de activitate
  
  cunoscută '
5. Aparatură
1. 5.1. Evaporator rotativ în vid, cu balon cu fund rotund de 250 ml.
2. 5.2. Coloana de sticlă pentru cromatografie, diametru intern: 25 mm, lungime: aproximativ 400 mm cu deschidere efilată de 2 mm diametru la o extremitate.
3. 5.3. Coloana de sticlă pentru cromatografie, diametru intern: 11 mm, lungime: aproximativ 300 mm deschidere efilată de 2 mm diametru la o extremitate.
6. Solutii etalon

Se diz'olvă o cantitate precis cântărită din substanţa

°

standard (4.8) în metanol (4.4) şi se diluează pentru a se obţine soluţia stoc ce conţine 800 µg /ml monenzin de sodiu. Se păstrează în flacoane închise la 4 C. Această soluţie este stabilă timp de maxim două săptămâni.

Din această soluţie stoc se prepară, prin diluţie succesivă cu 50% metanol, (4.6) următoarele soluţii

Sa – 8.0 µg/ml S4 – 4.0 µg/ml S2 – 2.0 µg/ml S1 – 1.0 µg/ml
7. Prepararea extractului
1. 7.1. Extracţie
  1. 7.1.1. Premixuri
    
    Se cântăreşte o cantitate de probă de 2 g, se adaugă 100 ml metanol 90% (4.5), se omogenizează şi se centrifughează timp de câteva minute. Se diluează soluţia de supernatant cu
    
    metanol 50% (4.6) pentru a se obţine· un conţinut dorit de monenzin de sodiu de 8 µg /ml ( = U8)
  2. 7.1.2. Furaje cu un nivel de monenzin de sodiu maxim de 50pmm
    
    Se cântăreşte o cantitate de probă de 10-20 g, se adaugă 100 ml metanol 90% (4.5), se omogenizează timp de 15 minute şi se lasă să se limpezească.
    
    Se introduce un tampon de vată în deschiderea efilată a tubului de sticlă (5.2) şi se adaugă oxid de aluminiu (4.7) şi se scutură uşor tubul până când coloana ajunge de la 75 la 80 mm
    
    înăltime.
    
    ' Se decantează extractul pe coloana de oxid de aluminiu şi
    
    se colectează filtratul, se diluează 30 ml până la 50 ml filtrat cu apă. Se fac următoarele diluţii cu metanol 50% (4.6) până se obţine un conţinut dorit de monenzin de sodiu de 8 µg /ml ( = Ua)
  3. 7.1.3. Furaje cu un nivel de monenzin de sodiu mai mic de 50 pmm ( până la limita de 1O ppm)
    
    Se cântăreşte o cantitate de probă de 10-20 g, se adaugă
    
    100 ml metanol 90% (4.5) şi se omogenizează timp de 15 minute. Se centrifughează până devine limpede.
    
    °
    
    Se prelevează 40 ml lichid supernatant pentru o probă ce conţine 20 ppm monenzin de sodiu. Se prelevează 80 ml pentru o probă ce conţine 1O ppm şi se evaporă până la uscare sub vid la un evaporator rotativ (5.1) la maxim 40 C, se dizolvă reziduul în 1O ml metanol 90% (4.5).
    
    Se introduce un tampon de vată în deschiderea efilată a tubului de sticlă (5.3) şi se adaugă oxid de aluminiu (4.7) şi scutură uşor tubul până când coloana ajunge de la 75 la 80 mm
    
    înăltime.
    
    ' Se decantează soluţia metanoică de reziduu de pe
    
    coloana de oxid de aluminiu şi se colectează filtratul. Se spală coloana cu 1O ml metanol 90% (4.5) şi se combină lichidele de spălare cu filtratul.
    
    °
    
    Se evaporă soluţia până la uscare sub vid la un evaporator
    
    rotativ (5.1), la maxim 40 C. Se dizolvă reziduul în 1O ml metanol anhidru (4.4) şi se aduce la semn cu 20 ml apă. Se centrifughează soluţia la minim 4000 r/min, timp de cel puţin
    
    cinci minute. Se fac următoarele diluţii cu metanol 50% (4.6) până se obţine un conţinut dorit de monenzim de sodiu de 8 µg
    
    /ml ( = Ua)
2. 7.2. Soluţii probă
  
  Pentru soluţia U8 se prepară soluţiile U4 (conţinut evaluat: 4 µg/ml), U2(conţinut evaluat: 2 µg/ml) şi U1(conţinut evaluat: 1 µg/ml) prin diluţii succesive (1+1) cu metanol 50% (4.6).
8. Procedura de testare
1. 8.1. Însământarea mediului de testare
  
  Se însămânţe' ază mediul de testare (4.2) cu suspensie de
  
  spori (3.2) la 50-60 °c. Prin experimente preliminare pe plăci cu mediu de testare (4.2). se determină cantitatea de suspensie de spori necesară pentru a determina cele mai întinse şi mai clare
  
  zone de inhibitie cu diferite concentratii în monenzin de sodiu.
2. 8.2. Prepa' rarea plăcilor de însăm' ânţare
  
  Difuzia pe agar este efectuată în plăci, utilizâdu-se patru concentraţii din soluţia etalon (Sa S4 S2 S1 ) şi patru concentraţii din soluţia probei (Ua, U4,U2, U1). Aceste patru concentraţii ale extractului şi etalonului trebuie, în mod necesar, să fie plasate
  
  în fiecare placă. În acest scop, se aleg plăci destul de mari pentru a permite să fie realizate în mediu de agar cel puţin opt godeuri cu un diametru de 1O până la 13 mm şi la nu mai puţin de 30 mm între centre. Testul poate fi efectuat pe plăci formate dintr-o placă de sticlă cu o faţă din aluminiu sau un inel din plastic plasat în vârf, 200 mm în diametru şi 20 mm înălţime.
  
  Se toarnă în plăci o cantitate din mediul (4.2), însămânţat cum este indicat la punctul 8.1., pentru a se obţine un strat de aproximativ 2 mm grosime (60 ml pentru o placă de 200 mm diametru). Se lasă să se solidifice, se realizează godeuri şi se pun în acestea volume de probă exact măsurate şi soluţii standard (între O,1O şi O,15 ml/godeu, conform diametrului). Se utilizează fiecare concentraţie de cel puţin patru ori, astfel încât fiecare determinare să fie supusă unei evaluări a 32 zone de inhibitie.
  
  8' .3. lncubatie
  
  Se incubea'ză plăcile timp de aproximativ 18 ore, la 35 –
  
  37°c.
9. Evaluare

Se măsoară diametrul zonelor de inhibiţie cu o aproximaţie de O,1 mm. Se înregistrează valorile •medii pentru fiecare concentraţie pe hârtie grafică semi-logaritmic ce indică logaritmul concentraţiilor în raport cu, diametrul zonelor de inhibiţie. Se trasează liniile cele mai potrivite atât pentru soluţia etalon cât şi pentru extract ca în exemplul de mai jos.

Se determină punctul ăcel mai potrivit" pentru cel mai scăzut nivel (SL) utilizând formula:

a) S=L

7S1 +4S2 +S-42S8

10

Se determină punctul ăcel mai potrivit" pentru nivelul

standard cel mai ridicat (SH) utilizând formula:
b) SH= 7S8+4S4 +S-22S1

Se calculează în mod similar punctele ăcele mai potrivite" pentru nivelul cel mai scăzut de extract (UL) şi nivelul cel mai înalt de extract (UH) prin substituirea U1,U2 şi U4 cu S1, S2 şi S4 şi S8 din formula menţionată mai sus.

Se înregistrează valorile calculate ale SL şi SH, pe aceeaşi hârtie grafică şi se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită" pentru soluţia etalon. Se înregistrează în mod similar UL şi UH şi se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită" pentru extract.

În absenta oricărei interferente liniile trebuie să fie

paralele. Pentr' u scopuri practice l'iniile pot fi considerate paralele dacă valorile (SH-SL) şi (UH-UL) nu diferă mai mult de 10% ca valoare medie a acestora.

Dacă liniile nu sunt paralele fie U1 şi S1 fie U8 şi S8 pot fi eliminate şi SL, SH, UL şi UH calculate, utilizând formula alternativă, pentru a da liniile alternative ăcele mai potrivite”.

(a') S=L

5S1 +2S2 -2S4sau 5S2 +2S4 -S8

6 6

(b') sH= ss4 +2s-2s1 sau 5S8+2s-4s2

6 6

şi în mod similar pentru UL şi UH. Trebuie să fie respectate aceleaşi criterii de paralelism Faptul că rezultatul a fost calculat pe baza celor trei nivele trebuie să fie notat în raportul final.

Atunci când liniile sunt considerate ca fiind paralele, se calculează logaritmul activităţii relative '(log A) prin intermediul uneia din următoarele formule:

Pentru patru nivele

(c) LogA= (Ul +U2 +U4 +Ug-S -S2-S4-Sg)X0,602

U4 +U8 +S4 +S8 -U, -U2 -S, -S2

Pentru trei nivele
(d) LogA= (U, +U2+U4-S, -S2-S4)X0,401

U4 +S4 -Ul -s,

(d') LogA= (U2+U4 +U8 -S2 -S4-S8)x0,401

U8 +S8 -U2 -S2

Activitatea reală – activitatea presupusă x activitatea reală Dacă activitatea relativă este în afara gamei de valori

cuprinse între 0,5 şi 2,0, atunci se repetă proba făcând ajustări corespunzătore ale concentraţiilor extractului sau dacă aceasta nu este posibil, ale soluţiilor etalon. Atunci când activitatea relativă nu poate fi adusă în gama de valori solicitată, orice rezultat obţinut trebuie să fie considerat ca aproximativ şi acesta trebuie notat în raportul final.

Atunci când liniile sunt considerate ca nefiind paralele, se repetă determinarea. Dacă paralelismul nu este totuşi realizat,

înseamnă că nu a fost obtinută o determinare satisfăcătoare.

1O. Repetabilitate '

Diferenţa între rezultatele celor două determinări paralele efectuate pe aceleaşi probă prin aceeaşi analiză nu trebuie să depăşească

– 20% în raport cu valoarea cea mai mare pentru niveluri de la 1O până la 25 mg/kg,
– 5 mg/kg, în valoare absolută, pentru niveluri de la 25 până la 50 mg/kg,
– 10% raport cu valoarea cea mai mare pentru niveluri mai mari de 50 mg/kg.

i(1) Pot fi utilizate alte metode, cu condiţia să se fi stabilit că acestea utilizează suspensii de spori similare

(a) Poate fi utilizat orice mediu comercial de cultură de compoziţie similară ce oferă aceleaşi rezultate

(b) 1 mg monenzin de sodiu este echivalent cu 1000 unităţi UK

AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR

O R D I N

pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește metode naționale de analiză

pentru determinarea aminoacizilor, uleiurilor și grăsimilor brute și a olaquindoxului din furaje*)

Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia,

văzând Referatul de aprobare nr. 154.288 din 28 mai 2004 al Direcției generale veterinare,

președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin:

Art. 1. — Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metode naționale de analiză pentru determinarea aminoacizilor, uleiurilor și grăsimilor brute și a olaquindoxului din furaje, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art. 2. — Institutele centrale de profil, direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a

municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Art. 3. — Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin.

Art. 4. — Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor,

Liviu Harbuz

București, 10 iunie 2004.

Nr. 20.

*) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 20/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis.

**) Anexa este reprodusă în facsimil.

ANEXĂ

NORMĂ VETERINARĂ

ce stabilește metode naționale de analiză pentru determinarea aminoacizilor, uleiurilor și grăsimilor brute și a olaquindoxului din furaje

ANEXĂ

la norma veterinară

cromatografie cu schimbători de ioni şi determinaţi prin reacţia cu ninhidrină utilizând detectarea fotometrică la lungimea de undă de 570 nm (440 nm pentru pralină).

3. Reactivi

Trebuie să se utilizeze apă bidistilată sau apă de calitate echivalentă (conductivitate<1o µs).
1. 3.1. Peroxid de hidrogen, w=30 %
2. 3.2. Acid formic, w=98-100 °/o
3. 3.3. Fenol
4. 3.4. Disulfit de sodiu
5. 3.5. Hidroxid de sodiu
6. 3.6. Acid 5-sulfosalicilic dihidrat
7. 3.7. Acid clorhidric, densitate aproximativ 1,18 g/ml
8. 3.8. Citrat de trisodiu dihidrat
9. 3.9. 2,2′ – Tiodietanol (tiodiglicol)
  
  3.1O. Clorură de sodiu
  punctul 5.3.3.1. şi destinate a fi utilizate cu extracte (5.2). Soluţia de etalonare este preparată în conformitate cu punctul· 3.27.4, dar fără clorură de sodiu.
  
  Se păstrează la o temperatura mai scăzută de 5 °e, timp de maxim 3 luni
4. Aparatură
1. 4.1. Balon cu fund rotund de 100 sau 250 ml prevăzut cu refrigerent de reflux.
2. 4.2. Flacon de sticlă borosilicică, cu capac filetat, cu
  
  garnitură de cauciuc/teflon, (ex. Duran, Schott) pentru utilizare în etuvă.
3. 4.3. Etuvă cu ventilaţie forţată şi regulator de temperatură, cu o precizie mai mare de +2 °e.
4. 4.4. pH – metru (gradaţie de trei zecimale)
5. 4.5. Filtru cu membrană (0,2 µm)
6. 4.6. Centrifugă
7. 4.7. Evaporator rotativ cu vid.
8. 4.8. Agitator mecanic sau magnetic
  
  l
  
  l
9. 4.9. Analizor de aminoacizi sau echipament HPLe cu coloană schimbătoare de ioni, dispozitiv pentru ninhidrină, derivaţie post-coloană şi detector fotometric. Coloana este prevăzută cu răşini polistiren sulfonate, pentru separarea diferiţilor aminoacizi unul de celălalt şi din alte materiale ninhidrin pozitive. Debitul de tampon şi ninhidrină este asigurat de pompe având un grad de stabilitate a fluxului de ± 0,5% în perioada ce acoperă ambele soluţii standard de etalonare şi de analiză a probei. Cu aceleaşi analizoare de aminoacizi se pot utiliza metode de hidroliză în care hidrolizatul are o concentratie de sodiu de c=0,8 mol/I şi conţine tot acidul formic rezidual provenit din oxidare. Altele nu pot asigura o separare satisfăcătoare a unor aminoacizi, dacă hidrolizatul cantine exces e acid formic şi/sau concentraţie crescută a ionilor de sodiu. ln acest caz volumul de acid este redus prin evaporare la aproximativ 5 ml, după hidroliză şi anterior de ajustarea pH-ului. Evaporarea trebuie să se facă sub vid, la maxim 40 °e.
5. Metodă de lucru
1. 5.1. Prepararea probei
  
  Proba este măcinată pentru a trece printr-o sită de 0,5
  
  mm. Probele cu umiditate ridicată trebuie, înainte de măcinare, uscate fiecare la aer, la o temperatură ce maxim 50 °e sau prin liofilizare. Probele cu un conţinut mare în grăsimi trebuie extrase cu eter de petrol (3.12), înainte de măcinare.
2. 5.2. Determinarea aminoacizilor liberi din furaje şi premixuri
  
  Se cântăreşte, cu o precizie de 0,2 mg, o cantitate corespunzătoare (1-5 g) de probă preparată (5.1), într-un pahar conic şi se adaugă 100,0 ml amestec de extracţie (3.21). Se agită amestecul timp de 60 minute utilizând un agitator mecanic sau un agitator magnetic (4.8). Sedimentul se lasă să se decanteze şi se pipetează 1O ml din soluţia de supernatant într un pahar de 100 ml.
  
  Se adaugă 5 ml soluţie de acid sulfosalicilic (3.22) agitându-se şi se continuă să se agite cu ajutorul agitatorului magnetic timp de 5 minute. Se filtrează sau se centrifughează supernatantul pentru îndepărtarea oricărui precipitat. Se pun 1O ml din soluţia ce rezultă într-un pahar de 100 ml şi se aduce pH ul la 2,20, utilizându-se soluţie de hidroxid de sodiu (3.18). Se transferă într-un balon cotat de volum corespunzător, utilizându se tampon citrat (3.24) şi se aduce la semn cu soluţie tampon(3.24).
  
  Dacă este utilizat un standard intern, se adaugă 1,00 ml standardul intern (3.27.3) pentru fiecare 100 ml soluţie finală şi se aduce la semn cu soluţie tampon (3.24).
  
  Se trece la etapa de cromatografie în conformitate cu punctul 5.4.
  
  Dacă extractele existente nu sunt examinate în aceeaşi zi, acestea trebuie să fie păstrate la o temperatură mai scăzută de
  
  5 °c.
3. 5.3. Determinarea aminoacizilor totali
  1. 5.3.1. Oxidare
    
    Se cântăreşte cu o precizie de 0,2 mg, de la O,1 la1 g de probă preparată (5.1) într-un:
    1. (i) balon cu fund rotund de 100 ml (4.1), pentru hidroliză deschisă (5.3.23) sau,
    2. (ii) balon cu fund rotund de 250 ml (4.1), dacă se cere o concentraţie scăzută de sodiu (5.3.3.1) sau,
    3. (iii) flacon de 100 ml prevăzut cu un capac filetat (4.2) (pentru hidroliză închisă 5.3.2.4.)
    Partea de probă cântărită trebuie să aibă un conţinut în azot de aproximativ 1O mg şi un conţinut în umiditate de maxim 100 mg.
    
    Se pune balonul/flaconul pe o baie de apă cu gheaţă şi se răceşte la O 0e, se adaugă 5 ml amestec de oxidare (3.23) şi se
    
    amestecă utilizând o spatulă de sticlă cu extremitatea îndoită. Se închide ermetic balonul/flaconul ce conţine spatula cu ajutorul unui film etanş (la aer), se pune baia de apă cu gheaţă
    
    ce conţine recipientul închis în frigider la O 0e şi se lasă timp de
    
    16 ore. După 16 ore se scote din frigider şi se descompune
    
    excesul de reactiv de oxidare prin adăugarea de 0,84 g disulfit de sodiu (3.4).
    
    Se continuă ca la punctul 5.3.2.1.
  2. 5.3.2. Hidroliza
    1. 5.3.2.1. Hidroliza probelor oxidate
      
      La proba oxidată preparată în conformitate cu punctul 5.3.1, se adaugă 25 ml amestec hidrolizat (3.20), avându-se grijă să se spele orice reziduu ce aderă la suprafaţa vasului şi a spatulei. în funcţie de procedura de hidroliză utilizată se continuă în conformitate cu punctele 5.3.2.3. sau 5.3.2.4.
    2. 5.3.2.2. Hidroliza probelor neoxidate
      
      Se cântăreşte în oricare balon cu fund rotund de 250 ml sau de 100 ml (4.1) sau într-un flacon de 100 ml prevăzut cu un capac filetat (4.2), cu o precizie de 0,2 mg de la O,1 la 1 g de probă preparată (5.1). Partea de probă cântărită trebuie să aibă un conţinut de azot de aproximativ 1O mg. Se adaugă cu atenţie 25 ml amestec de hidroliză (3.20) şi se amestecă cu proba.
      
      Se continuă în conformitate cu punctele 5.3.2.3. sau 5.3.2.4.
    3. 5.3.2.3. Hidroliză deschisă
      
      Se adaugă 3 bile de sticlă amestecului din balon (preparat în conformitate cu punctele 5.3.2.1. sau 5.3.2.2) şi se fierbe cu clocotire continuă timp de 23 ore. În completarea hidrolizei se spală condensatorul cu 5 ml tampon citrat (3.24). Se deconectează balonul şi se răceşte într-o baie cu gheaţă. Se continuă în conformitate cu punctul 5.3.3.
    4. 5.3.2.4. Hidroliză închisă
      
      Se pune flaconul ce conţine amestecul preparat în
      
      conformitate cu punctele 5.3.2.1 sau 5.3.2.2 într-o etuvă (4.3) la 11O 0c. în timpul primei ore, pentru a se preveni creşterea presiunii (datorită emanării substanţelor gazoase) şi pentru a
      
      evita explozia, se pune capacul filetat la partea superioară a recipientului. Nu se închide recipientul cu capac. După o oră se închide recipientul cu capacul şi se lasă în etuvă (4.3) timp de
      
      23 de ore. În completarea hidrolizei se scoate flaconul din etuvă, se scoate cu atenţie capacul flaconului şi acesta se pune pe o baie de apă cu gheaţă. Se lasă la rece.
      
      În funcţie de procedura adoptată, pentru ajustarea pH-ului (5.3.3) se transferă gradual conţinutul din flacon într-un pahar gradat de 250 ml sau într-un balon cu fund rotund de 250 ml, utilizându-se tampon citrat (3.24).
      
      Se continuă în conformitate cu punctul 5.3.3.
  3. 5.3.3. Ajustarea pH-ului
    
    În functie de toleranta analizorului de aminoacid la sodiu, (4.9) se co'ntinuă în co'nformitate cu punctele 5.3.3.1 sau
    
    5.3.3.2., pentru ajustarea pH-ului
    1. 5.3.3.1. Pentru sistemele cromatografice (4.9) ce necesită
      
      o concentratie mică de sodiu:
      
      Se rec'omandă să se utilizeze o solutie standard stoc
      
      internă (3.27.3) atunci când sunt folosite' analizoare de
      
      aminoacizi ce necesită o concentraţie mică de sodiu (când volumul acidului trebuie să fie redus).
      
      În acest caz se adaugă hidrolizatului înaintea evaporării 2,00 ml soluţie standard stoc internă (3.27.3).
      
      Se adaugă 2 picături de 1-octanol (3;15) hidrolizatului obţinut în conformitate cu punctul 5.3.2.3 sau 5.3.2.4.
      
      Utilizându-se un evaporator rotativ (4.7) se reduce volumul la 5-1O ml, sub vacuum, la 40 °c. Dacă volumul este redus accidental la mai puţin de 5 ml, hidrolizatul trebuie eliminat şi
      
      analiza reluată.
      
      Se aduce pH-ul la 2,20 cu soluţie de hidroxid de sodiu (3.18) şi se continuă cu punctul 5.3.4.
    2. 5.3.3.2. Pentru toţi ceilalţi analizori de aminoacizi (4.9)
      
      Se iau hidrolizatele obţinute în conformitate cu punctul
      
      5.3.2.3 sau 5.3.2.4 şi se neutralizează parţial cu atenţie, adăugându-se şi agitându-se, 17 ml soluţie hidroxid de sodiu
      
      (3.17) asigurându-se că temperatura este menţinută sub 40 °c.
      
      Se aduce pH-ul la 2,20, la temperatura camerei, utilizându-se soluţie de hidroxid de sodiu (3.17) şi în final soluţie
      
      de hidroxid de sodiu (3.18). Se continuă la punctul 5.3.4.
  4. 5.3.4. Soluţia din probă pentru cromatografie
    
    Se transferă gradual hidrolizatul adus la pH (5.3.3.1 sau 5.3.3.2) cu soluţie tampon citrat (3.24) într-un balon gradat de 200 ml şi se aduce la semn cu tampon (3.24).
    
    Dacă intern nu a fost încă utilizat un standard se adaugă 2,00 ml standard intern (3.27.3) şi se aduce la semn cu tampon citrat (3.24). Se amestecă în întregime.
    
    Se procedează la etapa de cromatografie (5.4).
    
    Dacă soluţiile probei existente nu sunt examinate în
    
    aceeaşi zi, acestea trebuie să fie păstrate la o temperatură mai scăzută de 5 °c.
4. 5.4. Cromatografie
  
  Înainte de cromatografie se aduce extractul (5.2) sau hidrolizatul (5.3.4) la temperatura camerei. Se agită amestecul şi se filtrează o cantitate potrivită printr-un filtru cu membrană de 0,2µm (4.5). Soluţia clară obţinută este supusă cromatografiei cu schimbători de ioni, utilizându-se un analizor de aminoacizi.(4.9).
  
  Injecţia poate fi executată manual sau mecanic. Este important ca aceeaşi cantitate de soluţie ± 0,5 °/o să fie adăugată la coloană, pentru ca analiza de standarde şi probe, cu excepţia cazului în care se utilizează un standard intern şi rapoartele sodiu/aminoacid din soluţiile standard şi probă să fie, pe cât posibil, similare.
  
  În general frecvenţa injecţiilor depinde de stabilitatea reactivului ninhidrină şi a sistemului de analiză. Standardul sau proba este diluată cu tampon citrat (3.24) pentru a realiza o arie a picului standardului de 30-200% din aria picului probei de aminoacid.
  
  Cromatografia aminoacizilor se modifică uşor în conformitate cu tipul de analizor întrebuinţat şi răşina utilizată. Sistemul ales trebuie să permită separarea aminoacizilor unii de alţii şi din materiile pozitive la ninhidrină. În cursul operaţiunii, sistemul cromatografic trebuie să dea un răspuns linear la schimbările privind cantităţile de aminoacizi adăugaţi la coloană.
  
  În timpul etapei de cromatografie raportul dintre partea superioară şi partea inferioară a curbei menţionate mai jos, se aplică atunci când este analizată o soluţie echimolară (a aminoacizilor existenţi determinaţi). Această soluţie echimolară trebuie să conţină cel puţin 30% din sarcina maximă a fiecărui
  
  aminoacid ce poate fi măsurat cu precizie cu ajutorul sistemului analizorului de aminoacizi (4.9)
  
  Pentru separarea treoninei de serină, raportul dintre partea inferioară şi picul curbei a celor mai de jos 2 aminoacizi de pe cromatogramă, suprapuşi parţial, nu trebuie să depăşească raportul 2:1O (dacă sunt determinate numai cist(e)ina, metionina, treonina şi lizina) Separarea insuficientă de picurile vecine influenţează nefavorabil determinarea). Pentru toţi ceilalţi aminoacizii separarea trebuie să fie mai bună de 1:1O.
  
  Sistemul trebuie să asigure că lizina este separată de artefactele de lizină şi ornitină.
6. Calcularea rezultatelor

Aria picurilor probei şi a standardului este măsurată pentru fiecare aminoacid individual şi este calculată cantitatea în g aminoacid/kg probă:

AxExMWxF=Q aminoacid/kg probă

BxWxlOOO

Dacă este utilizat un standard intern se multiplică cu: D

C

A=aria picului de hidrolizat sau extract

B= aria picului soluţiei standard de etalonare

C= aria picului standardului intern în hidrolizat sau extract

D= aria picului standardului intern sau a soluţiei standard de etalonare

MW= greutatea moleculară a aminoacidului ce este determinat E=concentraţia standardului în µmol/ml

W= greutatea probei (g) (corectată faţă de greutatea iniţială, dacă produsul este uscat sau degresat)

F=ml de hidrolizat total (5.3.4) sau ml calculaţi la volumul total diluat de extract (6.1)

Cistina sau cisteina sunt ambele determinate ca acid cisteic în hidrolizate ale probelor oxidate, dar calculate ca cistină (CGH12N2O4S2 MW 240,30 prin utilizarea MW 120,15 (=0,5 x

240,30)

Metionina este determinată în hidrolizate de probe oxidate ca metionin sulfonă, dar calculată ca metionină prin utilizarea MW de metionină: 149,21

Metionina liberă adăugată este determinată după extracţia ca metionină, pentru calculare se aplică aceeaşi MW.
1. 6.1. Volumul diluţiei totale a extractelor (F) pentru determinarea de aminoacizi liberi (5.2) se calculează în modul următor:
  
  F= l00mlx (10ml + 5ml)xVml
  
  10ml 10ml
  
  V=volumul extractului final

7. Evaluarea metodei

Metoda a fost testată printr comparaţie efectuată la nivel internaţional în 1990 utilizându-se patru furaje diferite (furaj combinat pentru porcine, furaj combinat pentru broileri, concentrat proteic, premix). Rezultatele după eliminarea deviaţiilor, a mediei şi a deviaţiei standard sunt redate în tabelul de mai jos:

Medii în g/kg

Substantă de referin' tă	Aminoacid
Substantă de referin' tă	Treonină	Cist(e)ină	Metionină	Lizină
Furaj combinat pentru porcine	6,94 n=15	3,01 n=17	3,27 n=17	9,55 n=13
Furaj combinat pentru broileri	9,31 n=16	3,92 n=18	5,08 n=18	13,93 n=16
Concentrat proteic	22,32 n=16	5,06 n=17	12,01 n=17	47,74 n=15
Premix	58,42 n=16	–	90,21 n=16	98,03 n=16

n=număr de laboratoare participante

7.1. Repetabilitate

Repetabilitatea exprimată ca ădeviaţie standard în cadrul laboratorului" a comparărilor menţionate mai sus este redată de tabelele următoare:

Deviaţia standard (S1) în cadrul laboratorului în g/kg

Substanta

de referin' tă

Aminoacid

Treonină

Cist(e)ină

Metionină

Lizină

Furaj

0,13

0,10

o,11

0,26

combinat pentru porcine	n=15	n=17	n=17	n=13
Furaj combinat pentru broileri	0,20 n=16	0,11 n=18	0,16 n=18	0,28 n=16
Concentrat proteic	0,48 n=16	0,13 n=17	0,27 n=17	0,99 n=15
Premix	1,30 n=16	–	2,19 n=16	2,06 n=16

n=număr de laboratoare participante

Coeficient de variaţie (0/o) pentru deviaţia standard în cadrul

laboratorulu,i	St🙂
Substanta de ' referintă	Aminoacid
Substanta de ' referintă	Treonină	Cist(e)ină	Metionină	Lizină
Furaj combinat pentru porcine	1,9 n=15	3,3 n=17	3,4 n=17	2,8 n=13
Furaj combinat pentru broileri	2,1 n=16	2,8 n=18	3,1 n=18	2,1 n=16
Concentrat proteic	2,7 n=16	2,6 n=17	2,2 n=17	2,4 n=15
Premix	2,2 n=16	–	2,4 n=16	2,1 n=16

n=număr de laboratoare participante

7.2. Reproductibilitate

Substanta de '

referintă

Aminoacid

Treonină

Cist(e)ină

Metionină

Lizină

Rezultatele pentru deviaţia standard între laboratoare, menţionate mai sus, sunt redate comparativ de tabelul de mai os.

Furaj combinat pentru porcine	0,28 n=15	0,30 n=17	0,23 n=17	0,30 n=13
Furaj combinat pentru broileri	0,48 n=16	0,34 n=18	0,55 n=18	0,75 n=16
Concentrat proteic	0,85 n=16	0,62 n=17	1,57 n=17	1,24 n=15
Premix	2,49 n=16	–	6,20 n=16	6,62 n=16

n=număr de laboratoare participante

Coeficient de variaţie (%) pentru deviaţia standard între laboratoare(St)

Substanta de referin' ţă	Aminoacid
Substanta de referin' ţă	Treonină	Cist(e)ină	Metionină	Lizină
Furaj combinat pentru porcine	4,1 n=15	9,9 n=17	7,00 n=17	3,2 n=13
Furaj combinat pentru broileri	5,2 n=16	8,8 n=18	10,9 n=18	5,4 n=16
Concentrat proteic	3,8 n=16	12,3 n=17	13,0 n=17	3,0 n=15
Premix	4,3 n=16	–	6,9 n=16	6,7 n=16

n=număr de laboratoare participante

8. Utilizarea materialelor de referintă

Aplicarea corectă a metodei tre' buie să fie verificată prin

efectuarea de măsurători repetate a materialelor de referinţă

certificate, atunci când acestea sunt disponibile. Este recomandată etalonarea cu solutie de etalonare certificată de

aminoacizi. '
9. Observatii

'
1. 9.1. Din cauza diferent,elor între analizorii de aminoacizi, trebuie luate ca indicator concentrat,iile finale ale solut,iilor de etalonare (vezi 3.27.4 şi 3.27.5) şi ale hidrolizatului (vezi 5.3.4).
  
  Limitele răspunsului linear al aparatului trebuie verificate pentru toţi aminoacizii.
  
  Soluţia etalon este diluată cu tampon citrat, pentru a se realiza picul ariilor din mijlocul câmpului.
2. 9.2. Atunci când este utilizat pentru analizarea hidrolizatelor, echipamentul de cromatografie lichidă de înaltă performanţă, condiţiile experimentale trebuie să fie optimizate în conformitate cu recomandările fabricantului.
3. 9.3. Prin aplicarea metodei pentru furaje ce conţin mai mult de 1% clorură (concentrate, furaje minerale, furaje suplimentare) poate apare o subevaluare a metioninei şi deci trebuie realizate tratamente speciale ce au fost făcute

PARTEA B

DETERMINAREA ULEIURILOR ŞI GRĂSIMILOR BRUTE

Determinarea uleiurilor si grasimilor brute se va face in conformitate cu metodele stabilite prin ăNorma veterinară ce stabileşte metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor privind umiditatea, bazele azotate volatile, fosforul total şi uleiurile şi grăsimile brute".

PARTEAC DETERMINAREA OLAQUINDOXULUI

(2-[N -21– (hidroxietil) carbamoil]-3-metilquinoxaline -N1, N4–

dioxid)

1. Scop şi aplicabilitate

Această metodă are ca scop determinarea olaquindoxului din furaje. Limita minimă a determinării este de 5 mg/kg.
2. Principiu

Proba este extrasă cu ajutorul amestecului de apă – metanol. Conţinutul în olaquindox este determinat prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă în fază inversă (HPLC) ce utilizează un detector cu UV.

Atunci când uleiul sau grăsimea face obiectul unei testări calitative ulterioare se înlocuiesc fragmentele de piatră ponce cu bile de sticlă.
3. Reactivi
1. 3.1. Metanol,
2. 3.2. Metanol grade HPLC
3. 3.3. Apă, grade HPLC
4. 3.4. Faza mobilă pentru HPLC:
  
  Apă (3.3) – metanol (3.2) amestec, 900 +100 (V+V)
5. 3.5. Substanţă standard : olaquindox pur
  
  (2-[N -2'- (hidroxietil) carbamoil]-3-metilquinoxaline -N1, N4–
  
  dioxid), E 851
  1. 3.5.1. Soluţie standard (etalon) stoc de olaquindox, 250µg/ml
    
    Se cântăresc, cu aproximaţie de O,1 mg, 50 mg olaquindox (3.5), într-un balon cotat de 200 ml şi se adaugă aproximativ 190 ml apă. Se pune apoi balonul timp de 20 minute într-o baie de ultrasunete (4.1). După tratament ultrasonic, se aduce soluţia la temperatura camerei, se aduce la semn cu apă şi se amestecă. Balonul cotat se înveleşte într-o folie de aluminiu şi se păstrează la frigider. Această soluţie trebuie să fie proaspăt preparată în fiecare lună.
  2. 3.5.2. Soluţie standard intermediară stoc de olaquindox, 25µg/ml
    
    Se transferă 1O ml soluţie standard (etalon) stoc (3.5.1) într-un balon cotat de 100 ml, se aduce la semn cu faza mobilă (3.4) şi se amestecă. Balonul se înveleşte într-o folie de aluminiu şi se păstrează la frigider. Această soluţie trebuie să fie proaspăt preparată în fiecare zi.
    
    3.5.3 Calibrarea (etalonarea) solutiilor:
    
    "lntr-o serie de baloane cotate de' 50 ml se transferă 1,0,
    
    2,0, 5,0, 10,0, 15,0 şi 20,0 ml din soluţia standard intermediară (3.5.2). Se aduce la semn cu faza mobilă (3.4) şi se amestecă. Balonul se înveleşte într-o folie de aluminiu. Aceste soluţii corespund concentraţiilor de 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 7,5 şi 10,0 µg/ml de olaquindox. Aceste soluţii trebuie să fie proaspăt preparate, în fiecare zi.
4. Aparatură
1. 4.1. Baie de ultrasunete
2. 4.2. Agitator mecanic
3. 4.3. Echipament HPLC cu detector cu ultraviolete, cu lungimi de undă variabile sau detector cu sistem de diode
  1. 4.3.1. Coloană de cromatografie lichidă: 350 mm x 4 mm, C 18, 1O µm sau o coloană echivalentă.
4. 4.4. Filtre cu membrană de 0,45 µm
5. Metodă de lucru

Notă: Olaquindoxul este sensibil la lumină. Toate procedurile se efectuează sub lumină difuză sau se utilizează sticlărie de chihlimbar.
1. 5.1. Generalităti
  1. 5.1.1. Trebuie a' nalizat un furaj martor pentru a se verifica
    
    absenţa olaquindoxului şi interferenţa substanţelor.
  2. 5.1.2. Trebuie efectuat o testare de randament, prin care se analizează un furaj martor ce a fost îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de olaquindox identică cu cea prezentă în probă. Pentru a se îmbogăţi la un nivel de 50 mg/kg, se transferă 10,0 ml soluţie standard (etalon) stoc (3.5.1) într-un pahar conic de 250 ml şi se evaporă soluţia până la aproximativ. 0,5 ml. Se adaugă 50 g din furajul martor, se amestecă în întregime şi se
    
    lasă timp de 1O minute, înainte de procedura de extractie.(5.2)
    
    A l
    
    Notă: ln cadrul acestei metode, furajul martor trebuie să fie
    
    similar, ca tip, cu cel al probei de cercetat, iar cu privire la analiză, nu trebuie să fie detectat olaquindoxul.
2. 5.2. Extractie
  
  Se cântăres' c, cu o precizie de O,1 g, aproximativ 50 g din
  
  probă. Se transferă într-un pahar conic de 1OOO ml, se adaugă 100,0 ml metanol (3.1).şi se introduce paharul timp de 5 minute într-o baie de ultrasunete (4.1). Se adaugă 41O ml apă şi se lasă în baia de ultrasunete timp de alte 15 minute. Se îndepărtează paharul din baia de ultrasunete, se agită timp de 30 minute pe un agitator (4.2) şi se filtrează printr-un filtru pliat. Se transferă 10,0 ml filtrat într-un balon cotat de 20 ml, se aduce la semn cu apă şi se amestecă. O parte alicotă se filtrează prin filtru cu membrană (4.4) (vezi punctul 9 Observaţie). Se procede ză la determinarea HPLC (5.3).
3. 5.3. Determinare HPLC
  1. 5.3.1. Parametri
    
    Următoarele condiţii sunt oferite pentru orientare, putând fi utilizate, cu condiţia să ofere rezultate echivalente:
    
    Coloană analitică (4.3.1),
    
    Fază mobilă (3.4): apă (3.3) – metanol (3.2) amestec, 900
    
    +100(V+V)
    
    Debit: 1,5 – 2 ml /minut, Lungime de undă: 380 nm, Volum injectat: 20 – 100 µI
    
    Se verifică stabilitatea sistemului cromatografic, se injectează soluţia de etalonare (3.5.3) ce conţine 2,5µg/ml, de câte ori este nevoie, până când sunt obţinute înălţimi ale picului şi timpi de retenţie constanţi.
  2. 5.3.2. Curbă de etalonare
    
    Se injectează fiecare soluţie de etalonare (3.5.3.) de câte ori este nevoie şi se măsoară media înălţimilor picurilor (ariilor) pentru fiecare concentraţie. Se reprezintă grafic o curbă de etalonare, utilizându-se mediile picurilor sau ariilor principale ale soluţiilor de etalonare, ca ordonate şi concentraţiile corespunzătoare în µg/ml, ca abscise.
  3. 5.3.3. Soluţia probei
    
    Se injectează extractul din probă (5.2) de câte ori este necesar, utilizându-se acelaşi volum luat pentru soluţiile de etalonare şi se determină înălţimea (aria) medie a picului de olaquindox.
6. Calcularea rezultatelor

Se determină concentraţia probelor în mg/ml din media înălţimilor (ariilor) picurilor de olaquindox a probelor, prin referire la curba de etalonare (5.3.2). Conţinutul probei în olaquindox w (µg/ml) este dat de următoarea formulă:

cxl000

w=–

A

m

ln care:

c = concentraţia extractului din probă în olaquindox, în µg/ml, m = masa părţii testate exprimată în g (5.2).
7. Validarea rezultatelor
1. 7.1. Identitate
  
  Identitatea produsului analizat poate fi confirmată prin co cromatografie sau prin utilizarea unui detector cu sistem de diode, prin care sunt comparate spectrul extractul din probă (5.2) şi al soluţiei de calibrare (3.5.3) ce conţine 5,0 µg/ml.
  1. 7.1.1. Co – cromatografia
    
    Un extract din probă (5.2) este îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi corespunzătoare din soluţia etalon (3.5.3). Cantitatea de olaquindox adăugată trebuie să fie similară cantităţii estimate de olaquindox detectată în extractul din probă.
    
    Numai înălţimea picurilor de olaquindox trebuie să crească după luarea în calcul a ambelor cantităţi adăugate şi diluarea extractului. Lărgimea picului, la jumătate din înălţimea maximă, trebuie să se încadreze în ± 10%> din lărgimea originală a picului de olaquindox al extractului din proba neîmbogăţită.
  2. 7.1.2. Detectarea prin sistemul de diode

Rezultatele sunt evaluate în conformitate cu următoarele criterii:

a) Lungimea de undă a absorbţiei maxime a probei şi a spectrelor standard, înregistrate pe cromatogramă la vârful picului, trebuie să fie aceeaşi, cu o limită de siguranţă determinată de puterea de rezoluţie a sistemului de detectare. Pentru detectare prin sistemul de diode, aceasta este tipică în cadrul a+ 2 nm.
b) Între 220 şi 400 nm, spectrul standard şi al probei, înregistrate pe cromatogramă, la vârful picului, nu trebuie să fie diferite pentru acele părţi ale spectrului cuprinse între 1O şi 100% ale absorbţiei relative. Acest criteriu este îndeplinit când sunt prezente aceleaşi maxime şi când, la nici un punct observat, deviaţia între cele două spectre nu depăşeşte 15%

din absorbtia probei de analizat standard.

A I
c) Intre 220 şi 400 nm, spectrul curbei ascendente, al

vârfului şi al curbei descendente a picului, produse de extractul probei nu trebuie să fie diferit unul de celălalt pentru acele părţi ale spectrului în interiorul gamei de la 1O la 100%> de absorbţie relativă. Acest criteriu este îndeplinit când sunt prezente aceleaşi maxime şi când, la toate punctele observate, deviaţia

AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR

O R D I N

pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor în scopul identificării conținutului în halofuginonă*)

Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia,

văzând Referatul de aprobare nr. 153.354 din 26 mai 2004 al Direcției generale veterinare,

președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin:

Art. 1. — Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor în scopul identificării conținutului în halofuginonă, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art. 2. — Institutele centrale de profil, direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a

municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Art. 3. — Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin.

Art. 4. — Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor,

Liviu Harbuz

București, 10 iunie 2004.

Nr. 21.

*) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 21/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis.

**) Anexa este reprodusă în facsimil.

ANEXĂ

NORMĂ VETERINARĂ

ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor în scopul identificării conținutului în halofuginonă

ANEXĂ

la norma veterinară

Într-o serie de baloane cotate de 100 ml se transferă 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 şi 6,0 ml din soluţia standard (etalon) stoc (3.6.1). Se aduce la semn cu faza mobilă (3.2.1) şi se amestecă. Aceste soluţii corespund concentraţiilor de 2,0, 3,0, 4,0, şi 6,0 mg/ml de halofuginonă. Aceste soluţii trebuie să fie proaspăt preparate, înainte de utilizare.

3.7. Acid clorhidric (r 20 aproximativ 1,16 g/ml)
3.8. Metanol
3.9. Azotat de argint

3.1O. Ascorbat de sodiu

3.11. Carbonat de sodiu
3.12. Clorură de sodiu
3.13. EDTA (sare disodică a acidului etilendiamintetraacetic)
3.14. Apa distilata grade HPLC
3.15. Soluţie de carbonat de sodiu, v = 1Og/100 ml
3.16. Solutie de carbonat de sodiu saturată în clorură de sodiu, v = 5g/10'0 ml

Se dizolvă 50 g carbonat de sodiu (3.11) în apă, se diluează până la 1 litru şi se adaugă clorura de sodiu (3.12) până când soluţia devine saturată.
3.17. Acid clorhidric, aproximativ O,1 mol/I

Se diluează 1O ml HCI (3.7) cu apă până la 1 litru.
3.18. Soluţie tampon de acetat de amoniu, aproximativ

0,25

Se dizolvă 19,3 g acetat de amoniu (3.3) şi 30 ml acid

acetic(3.5) în apă (3.14) şi se diluează până la 1 litru.
3.19. Prepararea răşinii Amberlite XAD-2

Se spală o cantitate corespunzătoare de Amberlite (3.2) cu apă până se elimină toţi ionii de clorură, aşa cum este indicat printr-un test cu nitrat de argint efectuat în faza apoasă eliminată. Apoi se spală răşina cu 50 ml metanol (3.8), se înlătură metanolul şi se păstrează răşina în metanol proaspăt.
3.20. Soluţie nitrat de argint, aproximativ O,1 mol/I Se dizolvă O,17 g nitrat de argint (3.9) în 1O ml apa.
3.21. Faza mobilă HPLC

Se amestecă 500 ml acetonitril (3.1) cu 300 ml soluţie tampon acetat de amoniu (3.18) şi 1200 ml apa (3.14). pH-ul se

ajustează la 4,3, utilizându-se acid acetic (3.5). Se filtrează prin filtru de 0,22 mm (4.8) şi se degazează soluţia ( ex. prin ultrasunete timp de 1O minute). Această soluţie este stabilă timp de o lună, dacă este păstrată la întuneric într-un recipient închis.

4. Aparatură
1. 4.1. Baie de ultrasunete
2. 4.2. Evaporator cu film rotativ
3. 4.3. Centrifugă
4. 4.4. Echipament HPLC cu detector UV cu lungimi de undă variabile sau detector cu sistem de diode in linie
  1. 4.4.1. Coloană de cromatografie lichidă: 300 mm x 4 mm, C 18, 1O mm sau o coloană echivalentă.
5. 4.5. Coloană de sticlă (300 mm x 1O mm) prevăzută cu filtru din sticlă sinterizată şi robinet
6. 4.6. Filtre din fibre de sticlă, diametru 150 mm
7. 4.7. Filtru cu membrană de 0,45 mm
8. 4.8. Filtru cu membrană de 0,22 mm
5. Metodă de lucru

Notă: Halofuginona ca bază liberă este instabilă în soluţii alcaline şi de acetat de etil. Aceasta nu trebuie să rămână în acetat de etil mai mult de 30 minute .
1. 5.1. Generalităti
  1. 5.1.1. Trebuie a' nalizat un furaj martor pentru a se verifica
    
    absenţa halofuginonei şi interferenţa substanţelor.
  2. 5.1.2. Trebuie efectuat un test de randament prin care se analizează un furaj martor ce a fost îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de halofuginonă identică cu cea prezentă în probă. Pentru a se îmbogăţi la un nivel de 3 mg/kg, se adaugă 300 ml soluţie standard (etalon) stoc (3.6.1) la 1O g din furajul martor, se amestecă şi se aşteaptă timp de 1O minute înainte de procedura de extracţie.(5.2)
    
    Notă: În cadrul acestei metode, furajul martor trebuie să fie similar, ca tip, cu cel al probei de cercetat, iar cu privire la analiză, nu trebuie să fie detectată halofuginona.
2. 5.2. Extractie
  
  Se cântăre'sc, cu o precizie de O,1 g, 1O g din proba
  
  preparată într-un tub de'centrifugă de 200 ml, se adaugă 0,5 g
  
  ascorbat de sodiu (3.1O), 0,5 ml EDTA (3.13) şi 20 ml apă şi se amestecă. Se transferă într-un pahar conic de 250 ml şi se adaugă 100,0 ml metanol acidifiat (3.2). Se introduce tubul timp de 5 minute într-o baie de apă (80 °C). După răcire la temperatura camerei, se adaugă 20 ml soluţie carbonat de sodiu (3.15) şi se amestecă. Imediat se adaugă 100 ml acetat de etil (3.4) şi se agită energic timp de 15 secunde. Apoi se introduce tubul timp de trei minute în baia de ultrasunete (4.1) şi se desface dopul. Se centrifughează timp de 2 minute şi se decantează faza de acetat de etil prin filtrul din fibră de sticlă (4.6), într-o pâlnie de separare de 500 ml. Se repetă extracţia probei cu a doua parte de 100 ml de acetat de etil. Se spală extractele combinate timp de un minut cu 50 ml soluţie de carbonat de sodiu saturată în clorură de sodiu (3.16) şi se înlătură faza apoasă.
  
  Se extrage faza organică timp de 1 minut cu 5 ml acid clorhidric (3.17). Se transferă faza acidă inferioară într-o pâlnie de separare de 250 ml. Se extrage din nou faza organică timp de 1,5 minute cu o altă parte de 50 ml acid clorhidric şi se combină cu primul extract. Se spală extractele acide combinate prin agitare timp de aproximativ 1O secunde cu 1O ml acetat de etil (3.4).
  
  Se transferă cantitativ faza apoasă într-un balon cu fund rotund de 250 ml şi se elimină faza organică. Se evaporă tot
  
  restul de acetat de etil din soluţia acidă utilizând un evaporator cu film rotativ (2.4) temperatura băii de apă nu trebuie să depăşească 40 °c. Sub un vid de aproximativ 25 mbar toate reziduurile de acetat de etil trebuie să se elimine în 5 minute, la 38 °c
3. 5.3. Purificarea
  1. 5.3.1. Prepararea coloanei de Amberlite
    
    Pentru fiecare extract de probă se prepară o coloană XAD-
    
    2. (3.8), Se transferă 1O g de Amberlite preparat într-o coloană de sticlă cu metanol (4.5). Se adaugă un mic tampon de vată de sticlă deasupra stratului de răşină Se scurge metanolul din coloană cu metanol şi se spală răşina cu 100 ml apă, oprind scurgerea în momentul în care lichidul ajunge la suprafaţa stratului de răşină. Coloana se lasă să se stabilizeze timp de 1O
    
    minute înainte de utilizare. Niciodată nu se lasă coloana să se usuce.
  2. 5.3.2. Purificarea probei
    
    Extractul se transferă (5.2) la suprafaţa coloanei de Amberlite preparată (5.3.1)şi se eluează, îndepărtând eluantul. Viteza de eluţie nu trebuie să depăşească 20 ml/minut. Se clăteşte balonul cu fund rotund cu 20 ml acid clorhidric (3.17) şi se utilizează această soluţie la spălarea coloanei răşinii. Se suflă asupra soluţiei de acid ce a rămas cu un curent de aer. Se îndepărtează lichidele de spălare. Se adaugă 100 ml metanol (3.8), în coloană şi se lasă să elueze 5 -1O ml colectând eluantul într-un balon cu fund rotund de 250 ml. Metanolul rămas se lasă timp de zece minute să se stabilizeze cu răşina şi se continuă eluţia la o viteză ce nu depăşeşte 20 ml/minut, colectând eluantul în acelaşi balon cu fund rotund. Se evaporă metanolul cu ajutorul evaporatorului cu film rotativ (4.2), temperatura băii de apă nu trebuie să depăşească 40° C. Se transferă cantitativ reziduul într-un balon cotat de 1O ml utilizând faza mobilă (3.21). Se aduce la semn cu faza mobilă şi se amestecă. O parte alicotă este filtrată prin membrana filtrului (4.7). Această soluţie se stochează pentru determinare HPLC (5.4).
4. 5.4. Determinare HPLC
  1. 5.4.1. Parametri
    
    Următoarele condiţii sunt oferite pentru orientare, putând fi utilizate, cu condiţia să ofere rezultate echivalente:
    
    Coloana de cromatografie lichidă (4.4.1), faza mobilă HPLC (3.21),
    
    Debit: 1,5 – 2 ml /minut, Lungime de undă: 243 nm, Volum injectat: 40 – 100 ml
    
    Se verifică stabilitatea sistemului cromatografic, se injectează soluţia de etalonare (3.9.3) ce conţine 3,0 mg/ml, de câte ori este nevoie, până când sunt obţinute înălţimi sau arii ale picului şi timpi de retenţie constanţi.
  2. 5.4.2. Curba de etalonare
    
    Se injectează fiecare soluţie de etalonare (3.6.2.) de câte ori este nevoie şi se măsoară înălţimile picurilor(ariilor) pentru
    
    fiecare concentraţie. Se reprezintă grafic o curbă de etalonare utilizând mediile picurilor sau ariilor principale ale soluţiilor de etalonare ca ordonate şi concentraţiile corespunzătoare în mg/ml ca abscise.
  3. 5.4.3. Soluţia probei
    
    Se injectează extractul probei (5.3.2) de câte ori este necesar, utilizând aceleaşi volume luate drept soluţii de etalonare şi se determină înălţimea (aria) medie a picului de halofuginonă.
6. Calcularea rezultatelor

Se determină concentraţia probelor în mg/ml din media înălţimilor (ariilor) picurilor de halofuginonă a probelor, prin referire la curba de etalonare (5.4.2).

Conţinutul probei în halofuginonă w (mg/ml) este dat de următoarea formulă:

w

cxlO

=–

m

În care:

c = concentraţia probei în halofuginonă, în mg/ml, m = masa probei exprimată în g
7. Validarea rezultatelor
1. 7.1. Identitate
  
  Identitatea produsului analizat poate fi confirmată prin co cromatografie sau prin utilizarea unui detector cu sistem de diode, prin care sunt comparate spectrul extractului probei şi al soluţiei de calibrare (3.6.2) ce conţine 6 mg/ml.
  1. 7.1.1. Co – cromatografia
    
    Un extract al probei este îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi corespunzătoare din soluţia etalon (3.9.3). Cantitatea de halofuginonă adăugată trebuie să fie similară cantităţii estimate de halofuginonă detectată în extractul probei.
    
    Numai înălţimea picurilor de halofuginonă trebuie să crească după luarea în calcul a ambelor cantităţi adăugate şi diluarea extractului. Lărgimea picului, la jumătate din înălţimea
    
    maximă, trebuie să se încadreze în maxim ± 10°/c> din lărgimea initială.
    
    '
  2. 7.1.2. Detectarea prin sistemul de diode
    
    Rezultatele sunt evaluate în conformitate cu următoarele criterii:
    1. a) lungimea de undă a absorbţiei maxime a probei şi a
      
      spectrelor standard, înregistrate pe cromatogramă la vârful picului, trebuie să fie aceeaşi cu o limită de siguranţă determinată prin puterea de rezoluţie a sistemului de detectare. Pentru detectare prin sistemul de diode, aceasta este tipică în cadrul a +2 nm.
    2. b) între 225 şi 300 nm, spectrul standard şi al probei,
      
      înregistrate pe cromatogramă, la vârful picului, nu trebuie să fie diferite pentru acele părţi ale spectrului cuprinse între 1O şi 100% ale absorbţiei relative. Acest criteriu este îndeplinit când sunt prezente aceleaşi maxime şi când la nici un punct observat deviaţia între cele două spectre nu depăşeşte 15% din absorbţia probei de analizat standard.
    3. c) între 225 şi 300 nm, spectrul curbei ascendente,al
    vârfului şi al curbei descendente a picului, produse de extractul probei nu trebuie să fie diferit unul de celălalt pentru acele părţi ale spectrului în interiorul gamei de la 1O la 100% de absorbţie relativă. Acest criteriu este îndeplinit când sunt prezente aceleaşi maxime şi când la toate punctele observate deviaţia între spectre nu depăşeşte 15% din absorbţia spectrului vârfului. Dacă unul din aceste criterii nu este îndeplinit, prezenţa substantei de analizat nu este confirmată
    
    7.2'. Repetabilitate
    
    Diferenţa între rezultatele a 2 determinări paralele, efectuate pe aceeaşi probă, nu trebuie să depăşească 0,5mg/kg pentru un conţinut în halofuginonă, până la 3 mg/kg.
    
    7.3. Randament
    
    Pentru proba martor îmbogăţită, randamentul trebuie să fie de minim 80%.

8. Rezultatele unui studiu de colaborare

A fost organizat un studiu de colaborare C )în care trei probe au fost analizate în opt laboratoare.

Rezultate

	Proba A (Martor) la primire	Proba B (Făină)		Proba C 'Pelete)
	Proba A (Martor) la primire	la primire	după 2 luni	la primire	după 2 luni
Media (1)	n.d.	2,80	2,42	2,89	2,45
Sr	–	0,45	0,43	0,40	0,42
CVR	–	16	18	14	17
rec.		86	74	88	75

C) unităţi: în mg/kg n.d.: nedetectată

SR: deviaţia standard a reproductibilităţii CVR: coeficient de variaţie(%)

rec.: randament(%)

AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR

O R D I N

pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conținutul în spiramicină*)

Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia,

văzând Referatul de aprobare nr. 153.599 din 26 mai 2004 al Direcției generale veterinare,

președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin:

Art. 1. — Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conținutul în spiramicină, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin. Art. 2. — Institutele centrale de profil, direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a

municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Art. 3. — Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin.

Art. 4. — Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor,

Liviu Harbuz

București, 10 iunie 2004.

Nr. 22.

*) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 22/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis.

**) Anexa este reprodusă în facsimil.

ANEXĂ

NORMĂ VETERINARĂ

ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conținutul în spiramicină

ANEXĂ

la norma veterinară

de clorură de sodiu (4.3). Această suspensie poate fi menţinută timp de o săptămână la aproximativ la 4 °.c.

4. Mediu de cultură şi reactivi
1. 4.1. Mediu de cultură (b)
  
  Peptonă de carne 6,0 g
  
  Triptona 4,0 g
  
  Extract de drojdie de bere 3,0 g Extract de carne 1.5 g Glucoză 1,0 g
  
  Agar 10,0 – 20,0 g
  
  Apă 1000 ml
  
  pH 6,5 – 6,6 (după sterilizare).
2. 4.2. Mediul probei (b)
  
  Triptona 5,0 g
  
  Extract de drojdie de bere 4,0 g Extract de carne 3,0 g Agar 10,0 – 20,0 g
  
  Apă 1000 ml
  
  pH 8,0 (după sterilizare).
3. 4.3. Soluţie de clorură de sodiu 0,8%(w/v)
  
  Se dizolvă 8 g clorură de sodiu în apă şi se diluează până la 1OOO ml, se sterilizează.
4. 4.4. Tampon fosfat – bicarbonat, pH 8,0
  
  (4.4)
  
  Fosfat hidrogenat de potasiu K2HPO4 Fosfat dihidrogenat de potasiu KH2 PQ4 Carbonat acid de sodiu NAHCO3
  
  Apă până la
  16,7 g
  
  0,5 g
  
  20,0 g
  
  1000 ml fosfat -bicarbonat
  
  Spiramicină d' e activitate cunoscută (în UI).
5. Solutii etalon

Se dizo' lvă o cantitate precis cântărită din substanţa de

determinat şi de standard (4.6) în amestec (4.5) şi se diluează cu acelaşi amestec pentru a se obţine soluţia stoc ce conţine 1OOO Ul spiramicină/ml. Se păstrează în flacoane închise la 4°C această soluţie este stabilă timp de maxim cinci zile.

Din această soluţie stoc se prepară prin diluţii succesive cu ajutorul amestecului, (4.5) următoarele•soluţii

Sa 1 Ul/ml

S4 0,5 Ul/ml

S2 0,25 Ul/ml

S1 O,125 Ul/ml
6. Prepararea soluţiilor de extract şi de probă
1. 6.1. Extractie
  
  Se cântăre'şte o cantitate de probă de 20,0 g în cazul
  
  furajelor, de 1,0 până la 20,0 g pentru premixuri. Se adaugă
  
  100 ml de amestec (4.5) şi se agită timp de 30 minute. Se centrifughează sau se decantează şi se diluează soluţia de supernatant cu amestecul (4.5) pentru a se obţine o concentraţie evaluată de spiramicină de 1 Ul/ml ( = U8)
  
  Pentru niveluri evaluate de spiramicină din furaje, inferioare valorii de 2,5 mg/kg, extracţia trebuie să fie efectuată după cum urmează. Se cântăreşte o cantitate de probă de 20,0
  
  °
  
  g. Se adaugă 100 ml de amestec (4.5) şi se agită timp de 30 minute. Se centrifughează timp de câteva minute, se prelevează un volum de 50 ml din soluţia de supernatant şi se evaporă până timp de aproximativ 4 minute, la presiune redusă, în evaporatorul rotativ, la temperatură ce nu depăşeşte 40 C. Se diluează reziduul cu ajutorul amestecului (4.5), până se
  
  obţine o concentraţie dorită de spiramicină de 1 Ul/ml ( = U8)
2. 6.2. Soluţii probă
  
  Pentru soluţia U8 se prepară soluţiile U4(conţinut evaluat: 0,5 Ul/ml), U2 (conţinut evaluat: 0,25 Ul/ml) şi U1 (conţinut evaluat: O,125 Ul/ml) prin diluţii succesive (1+1) cu ajutorul amestecului (4.5).
7. Procedura de testare

l
1. 7.1. însământarea mediului de testare
  
  Se însămânţează mediul de testare (4.2) cu suspensie bacteriană (3.2) la aproximativ 50 ° C. Prin experimente
  
  preliminare pe plăci cu mediu de testare (4.2). se determină cantitatea de suspensie bacteriană necesară pentru a se determina cele mai întinse şi mai clare zone de inhibiţie cu diferite concentraţii în spiramicină
2. 7.2. Prepararea plăcilor de însămânţare
  
  Difuzia pe agar este efectuată în plăci utilizâdu-se patru concentraţii din soluţia etalon (Sa S4 S2 S1 ) şi patru concentraţii din soluţia probei (U8, U4,U2, U1). Aceste patru concentraţii ale extractului şi etalonului trebuie, în mod necesar să fie plasate în fiecare placă. În acest scop, se aleg plăci destul de mari pentru a permite să fie realizate în mediu de agar cel puţin opt godeuri cu un diametru de 1O până la 13 mm şi la nu mai puţin de 30 mm între centre. Testul poate fi efectuat pe plăci formate dintr-o placă de sticlă cu o faţă din aluminiu sau un inel din plastic plasat în vârf, 200 mm în diametru şi 20 mm înălţime.
  
  Se toarnă în plăci o cantitate din mediul (4.2), însămânţat cum este indicat la punctul 7.1., pentru a se obţine un strat de aproximativ 2 mm grosime (60 ml pentru o placă de 200 mm diametru). Se lasă să se solidifice, se realizează godeuri şi se pun în acestea volume de probă exact măsurate şi soluţii standard (între O,1O şi O,15 ml/godeu, conform diametrului). Se utilizează fiecare concentraţie de cel puţin patru ori, astfel încât fiecare determinare să fie supusă unei evaluări a 32 zone de inhibitie.
  
  7' .3. lncubatie
  
  Se incubea'ză plăcile timp de 16 până la 18 ore, la 30 ±
  
  2°c.
8. Evaluare

Se măsoară diametrul zonelor de inhibiţie cu o aproximaţie

de O,1 mm. Se înregistrează valorile medii pentru fiecare concentraţie pe hârtie grafică semi-logaritmic ce indică logaritmul concentraţiilor în raport cu diametrul zonelor de inhibiţie. Se trasează liniile cele mai potrivite atât pentru soluţia etalon cât şi pentru extract, ca în exemplul de mai jos.

Se determină punctul ăcel mai potrivit" pentru cel mai scăzut nivel (SL) utilizând formula:

a) SL= 7S1 +4S2+S4-2S8

10

Se determină punctul ăcel mai potrivit" pentru nivelul standard cel mai ridicat (SH) utilizând formula:
b) SH= 7Sg +4S4 +S2 -2S,

Se calculează în mod similar punctele ăcele mai potrivite" pentru nivelul cel mai scăzut de extract (UL) şi nivelul cel mai înalt de extract (UH) prin substituirea u1,U4 şi ua cu s1, s2 şi sa din formula menţionată mai sus C ).

Se înregistrează valorile calculate ale SL şi SH, pe aceeaşi hârtie grafică şi se unesc pentru a da linia ,,cea mai potrivită" pentru soluţia etalon. Se înregistrează în mod similar UL şi UH şi se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită" pentru extract.

În absenta oricărei interferente liniile trebuie să fie paralele. Pentr'u scopuri practice l'iniile pot fi considerate

paralele dacă valorile (SH-SL) şi (UH-UL) nu diferă mai mult de

10%, ca valoare medie a acestora.

Dacă liniile nu sunt paralele fie u1 şi s1 fie ua şi sa pot fi eliminate şi SL, SH, UL şi UH calculate, utilizând formula alternativă, pentru a da liniile alternative ăcele mai potrivite".

(a') SL=5S1+2S2-2S4sau 5S2+2S4-Sg

6 6

(b') sH= ss4+2s2– s1 sau 5S8 +2s4– s2

6 6

Literele mici s şi v se referă la diametrele zonelor de inhibitie.

A'tunci când liniile sunt considerate ca fiind paralele, se

calculează logaritmul activităţii relative (log A) prin intermediul uneia din următoarele formule, depinzând de faptul dacă au fost utilizate trei sau patru nivele pentru evaluarea paralelismului.

Pentru patru nivele

(C)

LogA=

(U1 +U2+U4 +Ug-SI -S2-S4 -Sg)X0,602

–'–=–- ; ;; .;. :c ; ;;

U4+Ug+S4 +Sg-Ul –U2 -Sl -S2

Pentru trei nivele

(d) LogA= (U1+U2+U4-S1-S2-S4)X0,401

U4+S4-U1-S1

(d') LogA= (U2+U4+U8-S2 -S4-S8)x0,401

U8 +S8 -U2 -S2

Activitatea extractului probei – activitatea standardului corespondent x A

(Ua = Sa x A)

Dacă activitatea relativă este în afara gamei de valori

Atunci când liniile sunt considerate ca nefiind paralele, se repetă determinarea. Dacă paralelismul nu este totuşi realizat, înseamnă că nu a fost obtinută o determinare satisfăcătoare.

Se exprimă rezultatu'l în miligrame de spiramicină bază pe kilogram de furaj.

9. Repetabilitate

Diferenţa între rezultatele celor două determinări paralele efectuate pe aceleaşi probă prin aceeaşi analiză nu trebuie să depăşească

2 mg/kg, în valoare absolută, pentru niveluri în spiramicină bază până la 1Og/kg,

20% în raport cu valoarea cea mai mare pentru niveluri de la 1O până la 25 mg/kg,

5 mg/kg, în valoare absolută, pentru niveluri de la 25 până la 50 mg/kg,

10% raport cu valoarea cea mai mare pentru niveluri mai mari de 50 mg/kg.

i(1) 1 mg spiramicină bază este echivalent cu 3200 unităţi intemaţionale(UI)

(3) Pot fi utilizate alte metode,cu condiţia să se fi stabilit că acestea utilizează suspensii bacteriene similare.

(b) Poate fi utilizat orice mediu comercial de cultură de compoziţie similară ce oferă aceleaşi rezultate.

AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR

O R D I N

pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor în scopul identificării conținutului în robenidină (E 750)

și metil benzoat*)

Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia,

văzând Referatul de aprobare nr. 153.183 din 26 mai 2004 al Direcției generale veterinare,

președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin:

Art. 1. — Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor în scopul identificării conținutului în robenidină (E 750) și metil benzoat, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art. 2. — Institutele centrale de profil, direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a

municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Art. 3. — Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin.

Art. 4. — Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor,

Liviu Harbuz

București, 10 iunie 2004.

Nr. 23.

*) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 23/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis.

**) Anexa este reprodusă în facsimil.

ANEXĂ

NORMĂ VETERINARĂ

ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor în scopul identificării conținutului în robenidină (E 750) și metil benzoat

ANEXĂ

la norma veterinară

3.7. Soluţie de fosfat monohidrogenat de sodiu, c = 0,025mol/l. Se dizolvă 3,55 g difosfat monohidrogenat anhidru (sau 4,45 g dihidrat sau 8,95 g dodecahidrat ) în apă (grade HPLC) într-un balon cotat de 1OOO ml, se aduce la semn şi se amestecă.
3.8. Faza mobilă HPLC

Se amestecă următorii reactivi:

650 ml acetonitril (3.3), 250 ml apa (grad – HPLC),

50 ml soluţie de fosfat dihidrogenat de potasiu (3.6),

50 ml soluţie de fosfat monohidrogenat disodic (3.7).

Se filtrează prin filtre de 0,22 om (4.6) şi se degazează soluţia, (ex. prin tratament cu ultrasunete timp de 1O minute)
3.9. Substanţa standard (de titrare)

Robedinidină pură: 1. 3-bis[(4-clorbenzidina)amino] guanidin hidroclorid, E 750.
1. 3.9.1 Soluţie standard stoc de robenidină: 300 mg/ml
  
  Se cântăresc cu aproximaţie de O,1 mg, 30 mg din substanţa standard (de titrare) de robenidină (3.9). Se dizolvă în metanol acidifiat (3.2) într-un balon cotat de 100 ml, se aduce la semn şi se amestecă. Balonul cotat se înveleşte într-o folie de aluminiu şi se păstrează la loc întunecos.
2. 3.9.2 Soluţie standard intermediară de robenidină: 12 mg/ml
  
  Se pun 10,0 ml din soluţia standard stoc (3.9.1) într-un balon cotat de 250 ml, se aduce la semn cu faza mobilă (3.8) şi se amestecă. Balonul cotat se înveleşte într-o folie de aluminiu şi se păstrează la loc întunecos.
3. 3.9.3 Calibrarea (etalonarea) solutiilor

A I

lntr-o serie de baloane cotate de 50 ml se transferă 5,0,

10,0, 15,0, 20,0 şi 25,0 ml din soluţia standard intermediară (3.9.2). Se aduce la semn cu faza mobilă (3.8) şi se amestecă. Aceste soluţii corespund concentraţiilor de 1,2, 2,4, 3,6, 4,8, şi 6,0 mg/ml de robenidină. Aceste soluţii trebuie să fie proaspăt preparate, înainte de utilizare.

4. Aparat
1. 4.1. Coloana de sticlă
  
  Construită din sticlă bruna prevăzută cu robinet şi un rezervor de aproximativ 150 ml capacitate, diametrul interior de la 1O la 15 mm, lungime 250 mm.
5. Metodă de lucru

Notă: Robenidina este sensibilă la lumină Sticla bruna trebuie utilizată la toate operaţiunile.
1. 5.1. Generalităti
  1. 5.1.1. Trebu'ie analizat un furaj martor pentru a se verifica
    
    absenţa robenidinei şi interferenţa substanţelor.
  2. 5.1.2. Trebuie efectuat un test de randament prin care se analizează un furaj martor ce este îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de robenidină identică cu cea prezentă în probă. Pentru a se îmbogăţi la un nivel de 60 mg/kg, se adaugă 3,0 ml soluţie etalon stoc (3.9.1) intr-un pahar conic de 250 ml. Soluţia se evaporă la c. 0,5 ml în curent de azot. Se adaugă 15 g din furajul martor, se amestecă şi se aşteaptă 1O minute înainte de procedura
    
    I
    
    de extractie.(5.2)
    
    A
    
    Nota: ln cadrul acestei metode, furajul martor trebuie să fie
    
    similar, ca tip, cu cel al probelor de cercetat şi cu privire la analiză, nu trebuie să fie detectată robenidina.
    
    l
2. 5.2. Extractia
  
  Se cântăresc cu o precizie de 0,01 g, aproximativ 15 g din proba preparată. Se transferă intr-un pahar conic de 250 ml şi se adaugă 100,0 ml metanol acidifiat (3.2). Se acoperă şi se agită timp de o oră la agitator.(4.2). Soluţia
  
  se filtrează prin hârtia de filtru din fibră de sticlă (4.5) şi se colectează integral filtratul într-un pahar conic de 150 ml. Se adaugă 7,5 g de sită moleculară (3.4), se acoperă şi se agită timp de 5 minute. Se filtrează imediat printr-un filtru din fibre de sticlă. Această soluţie se păstrează pentru etapa de purificare (5.3).
3. 5.3. Purificarea
  1. 5.3.1. Prepararea coloanei de oxid de aluminiu
    
    Extremitatea inferioară a coloanei de sticlă se obstruează cu un mic tampon de vată de sticlă (4.1) şi se tasează utilizând o baghetă de sticlă. Se cântăresc 11,0 g din oxidul de aluminiu preparat (3.5) şi se transferă în coloană. Trebuie să se aibă grijă să se minimizeze expunerea la aer în timpul acestei etape. Se loveşte uşor extremitatea inferioară a coloanei umplute pentru a se decanta oxidul de aluminiu.
  2. 5.3.2. Purificarea probei
    
    Cu ajutorul unei pipete, se transferă în coloană 5,0 ml din extractul de probă preparat la (5.2).Se lasă vârful pipetei închis până la peretele coloanei şi se permite soluţiei să fie absorbită pe oxidul de aluminiu. Se eluează robenidina din coloană utilizând 100 ml metanol (3.1), la un debit de 2 până la 3 ml/minut şi se colectează eluantul într-un balon cu fund rotund de 250 ml. Se evaporă soluţia de metanol până la uscare la 40° C, la presiune redusă, cu ajutorul evaporatorului rotativ (4.3). Se redizolvă reziduul în 3 până la 4 ml de fază mobilă (3.8) şi se transferă cantitativ într-un balon cotat de 1O ml. Se clăteşte balonul cu mai multe părţi de 1-2 ml fază mobilă şi se transferă aceste lichide de spălare în balonul cotat. Se aduce la semn cu acelaşi solvent şi se amestecă. O parte alicotă este filtrată prin membrana filtrului de 0,45 mm (4.7). Această soluţie se stochează pentru determinare HPLC (5.4).
    Se injectează extractul de probă (5.3.2) de câte ori este necesar, utilizând aceleaşi volume luate drept soluţii de etalonare şi se determină media înălţimilor picurilor (ariilor) de robenidină.
6. Calcularea rezultatelor

Din media înălţimilor (ariilor) picurilor de robenidina a probelor se determină concentraţia probelor în mg/ml prin referire la curba de etalonare (5.4.2).

Conţinutul probei în robenidina w (mg/ml) este dat de următoarea formulă:

cx200

w=–

m

În care:

c = concentraţia probei în robenidină, în mg/ml, m = masa probei exprimată în g
7. Validarea rezultatelor
1. 7.1. Identitate
  
  Identitatea produsului analizat poate fi confirmată prin co cromatografie sau prin utilizarea unui detector cu sistem de diode prin care sunt comparate spectrul extractului de probă şi soluţia de calibrare (3.9.3) ce conţine 6 mg/ml.
  1. 7.1.1. Co – cromatografia
    
    Un extract de probă este îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi corespunzătoare din soluţia etalon (3.9.3). Cantitatea de robenidină adăugată trebuie să fie similară cantităţii estimate de robenidină găsită în extractul de probă.
    
    Numai înălţimea picurilor de robenidină trebuie să crească după luarea în calcul a ambelor cantităţi adăugate şi diluarea extractului. Lărgimea picului, la jumătate din
    
    înăltimea maximă, trebuie să se încadreze în maxim 10°/o din l'ărgimea iniţială.
  2. 7.1.2. Detectarea prin sistemul de diode
    
    Rezultatele sunt evaluate în conformitate cu următoarele criterii:
    1. (a) lungimea de undă a absorbţiei maxime a probei şi a spectrelor standardului, înregistrate la vârful picului, pe cromatogramă, trebuie să fie aceeaşi, cu o limită de siguranţă determinată prin puterea
      
      de rezolutie a sistemului de detectare. Pentru
      
      detectare 'prin sistemul de diode, aceasta este
      
      tipică până la aproximativ 2 nm.
    2. (b) între 250 şi 400 nm, spectrele standard şI a probei, înregistrate la vârful picului pe cromatogramă, trebuie să fie diferite pentru acele părţi ale spectrului cuprinse între 1O şi 100% ale absorbţiei relative. Acest criteriu este îndeplinit când sunt prezente aceleaşi maxime şi când nu se observă vreo deviaţie între cele două puncte ale spectrului ce depăşeşte 15% din proba de analizat standard.
    3. (c) între 250 şi 400 nm, spectrele curbei ascendente, vârfului şi curbei descendente a picului, produse de extractul de probă nu trebuie să fie diferite unele de celelalte pentru acele părţi ale spectrului în interiorul gamei de la 1O la 100% de absorbţie relativă. Acest criteriu este îndeplinit când sunt prezente aceleaşi maxime şi când la toate punctele observate deviaţia intre spectre nu depăşeşte 15% din absorbţia spectrului vârfului.
2. 7.2.
3. 7.3.
  
  Dacă unul din aceste criterii nu este îndeplinit, prezenţa substanţei de analizat nu este confirmată
  
  Repetabilitate
  
  Diferenţa între rezultatele a 2 determinări paralele, efectuate pe aceeaşi probă, nu trebuie să depăşească
  
  10% din cel mai mare rezultat al continutului în robenidină, mai mare de 15mg/kg. '
  
  Randament
  
  Pentru proba martor îmbogăţită, randamentul trebuie să fie de minim 85%.
8. Rezultatele unui studiu de colaborare

A fost realizat, de către comunitate, un studiu de colaborare în 12 laboratoare, în care au fost analizate 4 probe de furaj pentru păsări şi iepuri, sub formă de făină sau pelete. Au fost efectuate analize duble pentru fiecare probă. Rezultatele sunt prezentate în tabelul următor: Rezultate

Media	27,00	27,99	43,6	40,1
mg/ml
Sr (mg/kg)	1,46	1,26	1,44	1,66
CVr (%)	5,4	4,5	3,3	4,1
Sr (mg/kg)	4,36	3,36	4,61	3,91
CVR (%)	16,1	12,0	10,6	9,7
Randamen	90,0	93,3	87,2	80,2
t (%)

Sr = deviaţia standard a repetabilităţii

CVr= coeficientul de deviaţie a repetabilităţii SR= deviaţia standard a reproductibilităţii CVR=coeficient de variaţie a reproductibilităţii

2. DETERMINAREA METIL BENZOATULUI

7-benziloxi-6- butii- 3- metoxicarbonil- 4-quinolona

1. Scop şi aplicabilitate

Această metodă are ca scop determinarea metil benzoatului din furaje.

Limita minimă a determinării este de 1 mg/kg.
2. Principiu

Metil benzoatul este extras din probă cu soluţie metanolică de acid metansulfonic. Extractul este purificat cu diclormetan prin cromatografie de schimb ionic şi apoi din nou cu diclormetan. Conţinutul în benzoat de metil este determinat prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă în fază inversă (HPLC) ce utilizează un detector UV.
3. Reactivi
1. 3.1. Diclormetan
2. 3.2. Metanol, grade HPLC
3. 3.3. faza mobilă HPLC:
  
  amestec de metanol (3.2) şi apă (grade HPLC) 75+25
  
  (v+v)
  
  filtrarea prin filtre de 0,22 mm (4.6) şi degazarea soluţiei, (ex. prin tratament cu ultrasunete timp de 1O minute)
4. 3.4. Solutie de acid metansulfonic, s = 2%
  
  Se d'iluează 20 ml acid metansulfonic până la 1OOO ml cu metanol (3.2).
5. 3.5. Solutie de acid clorhidric, s = 10%
  
  Se dilue'ază 100 ml acid clorhidric (P 20 c. 1,18 g/ml) cu apa
  
  pana la 1OOO ml.
6. 3.6. Amberlite CG-120 (Na), răşină schimbătoare de cationi, diametrul granulelor de la 100 la 200 mesh (0,074 – 0,038 mm)
  
  Răşina este retratată înaintea utilizării: se amestecă 100 g răşină cu 500 ml soluţie acid clorhidric (3.5) şi se încălzeşte pe o placă fierbinte, agintându-se continuu. Se
  
  lasă la rece pentru a se decanta acidul. Se filtrează prin hârtia de filtru sub vacuum. Se spală răşina de două ori cu 500 ml părţi apa şi apoi cu 250 ml etanol (3.2). Se spală răşina cu cele 250 ml părţi de metanol (3.2) şi se usucă prin trecerea aerului prin filtru.
  
  Răşina uscată se păstrează într-o sticlă închisă.
7. 3.7. Substanţa standard: metil benzoat pur (7-benziloxi-6- butil- 3- metoxicarbonil- 4-quinolona)
  1. 3.7.1. Soluţie stoc de metil benzoat, 500mg/ml
    
    Se cântăresc cu aproximaţie de O,1 mg, 50 mg din substanţa standard (3.7) se dizolvă în soluţie de acid metansulfonic (3.4). într-un balon cotat de 100 ml se completează până la semn şi se amestecă.
  2. 3.7.2. Solutie standard intermediară de metil benzoat, 50
    
    mg/ml '
    
    Se transfera 5,0 ml soluţie stoc de metil benzoat (3.7.1) într-un balon cotat de 50 ml, se aduce la semn cu metanol (3.2) şi se amestecă.
    
    I
  3. 3.7.3. Etalonarea solutiilor
    
    A
    
    lntr-o serie de baloane cotate de 25 ml se transferă 1,0,
    
    2,0, 3,0, 4,0, şi 5,0, ml de soluţie standard (etalon) intermediară de metil benzoat (3.7.2) Se aduce la semn cu faza mobilă (3.3) şi se amestecă. Aceste soluţii corespund concentraţiilor de 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 şi 10,0 mg/ml metil benzoat. Aceste soluţii trebuie să fie proaspăt preparate înainte de utilizare.
4. Aparat
1. 4.1. Agitator de laborator
2. 4.2. Evaporator rotativ
3. 4.3. Coloană de sticlă (250 mm x 15 mm) prevăzută cu robinet şi rezervor de aproximativ 200 ml capacitate.
4. 4.4. Echipament HPLC cu detector cu ultraviolete cu lungimi de undă variabile sau detector cu sistem de diode
  1. 4.4.1. Coloana cromatografică cu lichid: 300 mm x 4 mm, C
    
    – 18, 10 mm
5. 4.5. Filtru cu membrană de 0,22 mm
6. 4.6. Filtru cu membrană de 0,45 mm
5. Metodă de lucru
1. 5.1. Generalităti
  
  '
  1. 5.1.1. Un furaj martor trebuie analizat pentru a se verifica absenta metil benzenului sau a altor substante interferente.
    
    ' '
  2. 5.1.2. Trebuie efectuat un test de randament prin care se
    
    analizează un furaj martor ce este îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de metil benzoat, identică cu cea prezentă în probă. Pentru a se îmbogăţi la un nivel de 15 mg/kg, se adaugă 600 ml soluţie stoc (3.7.1) la 20 g furaj martor, se amestecă şi se aşteaptă 1O minute înainte de procedura de extractie.(5.2)
    
    A I
    
    Nota: ln cadrul acestei metode, furajul martor trebuie să fie
    
    ca tip, similar cu cel al probei, iar cu privire la analiză, nu trebuie să fie detectat metil benzoat.
2. 5.2. Extractia
  
  Se cân' tăreşte cu precizie de 0,01 g, aproximativ 20 g din
  
  proba preparată si se transferă într-un pahar conic de 250 ml. Se adaugă 100,0 ml soluţie de acid metansulfonic (3.4) şi se agită mecanic (4.1) timp de 30 minute. Soluţia se filtrează prin hârtia de filtru (4.1) şi se păstrează filtratul pentru etapa de separare lichid-lichid.
3. 5.3. Separarea lichidulichid
  
  Se transferă 25 ml filtrat obţinut, (5.2) într-o pâlnie de separare de 500 ml ce conţine 100 ml soluţie de acid clorhidric. Se adaugă 100 ml diclormetan (3.1), în pâlnie şi se agită un minut. Se lasă să se separe fazele şi se preia stratul inferior (diclormetan) într-un balon cu fund rotund de 500 ml. Se repetă extracţia fazei apoase cu celelalte două porţiuni de diclormetan a 40 ml şi se combină acestea cu primul extract din balonul cu fund rotund. Se evaporă extractul de diclormetan până la uscare la evaporatorul rotativ (4.2). ce funcţionează la presiune scăzută la 40° C. Reziduul se dizolvă în 20 până la 25 ml metanol (3.2), se pune dopul şi se conservă extractul total pentru cromatografie prin schimb ionic.(5.4).
4. 5.4. Cromatografie prin schimb ionic
  1. 5.4.1. Prepararea coloanei cu schimbători de cationi
    
    Se introduce un mic tampon de vată de sticlă la extremitatea inferioară a coloanei de sticlă. Se prepară o suspensie de 5 g de răşină schimbătoare de cationi (3.6) cu 50 ml acid clorhidric (3.5), se toarnă în coloana de sticlă şi se lasă să se stabilizeze. Se îndepărtează excesul de acid lăsându-l să se scurgă chiar deasupra suprafeţei răşinii şi se spală coloana cu apă până când este neutralizat cu turnesol. Se transferă 50 ml metanol (3.2) în coloană şi permite scurgerea de pe suprafaţa răşinii.
  2. 5.4.2. Cromatografie pe coloană
    
    Cu ajutorul unei pipete, se transferă cu grijă extractul obţinut în (5.3) coloană. Se clăteşte balonul cu fund rotund cu două părţi de 5 şi 1O ml metanol (3.2) şi se transferă aceste lichide de spălare în coloana. Se lasă extractul să se scurgă pe suprafaţa răşinii, se spală coloana cu 50 ml metanol şi se asigură că debitul nu este mai mare de 5 ml /min. Se înlătură eluantul. Se eluează metil benzoatul din coloană utilizând 150 ml soluţie de acid metansulfonic (3.4) şi se colectează eluantul din coloană într-un pahar conic de 250 ml.
5. 5.5. Separarea lichid-lichid
  
  Se transfera eluantul obţinut (5.4.2) într-o pâlnie de decantare de 1 litru. Se clăteşte paharul conic cu 5 până la 1O ml metanol (3.2) şi se combină lichidul de spălare cu conţinutul pâlniei de separare. Se adaugă 300 ml soluţie acid clorhidric (3.5) şi 130 ml diclormetan (3.1). Se agită timp de 1 minut şi se lasă să se separe fazele. Se lasă să se scurgă faza inferioară (diclormetan) într-un balon cu fundul rotund de 500 ml. Se repetă extracţia fazei apoase cu alte două părţi de 70 ml de diclormetan şi se combină aceste extracte cu primul într-un balon cu fundul rotund.
  
  Se evaporă extractul de diclormetan pana la uscare cu evaporatorul rotativ (4.2) ce funcţionează la presiune
  
  redusă şi la temperatura de 40 °c. Se dizolvă reziduul într
  
  un balon cu aproximativ 5 ml metanol (3.2) şi se transferă întreaga cantitate din această soluţie într-un balon cotat de 1O ml. Se clăteşte balonul cu fund rotund cu două noi părţi de 1 până la 2 ml metanol şi acestea se transferă într-un
  
  balon cotat. Se aduce la semn cu metanol si se amestecă. O porţiune alicotă este filtrată printr-un filtru cu membrană (4.6).Această soluţie se păstrează pentru analiza HPLC.(5.6).
6. 5.6. Determinarea HPLC
  1. 5.6.1. Parametri
    
    Următoarele condiţii sunt oferite pentru orientare, putând fi utilizate cu conditia să ofere rezultate echivalente:
    - – coloană cromato' grafică cu lichid (4.4.1)
    - – fază mobilă HPLC: amestec apă – metanol (3.3), – debit: de la 1 la 1,5 ml/minut.
    - – lungime de undă de detecţie: 265 nm, – Volum injectat de la 20 la 50 ml.
      
      Se controlează stabilitatea sistemului cromatografic, injectându-se soluţia de etalonare (3.7.3) ce conţine 4 mg/ml, de mai multe ori, până când se realizează înălţimile sau ariile picului şi timpii de retenţie fixaţi.
  2. 5.6.2. Curba etalon
    
    Se injectează fiecare soluţie de calibrare (etalonare) (3.7.3) la diferite intervale de timp şi se măsoară înălţimile (ariile) picurilor pentru fiecare concentraţie. Se reprezintă grafic o curbă de calibrare utilizându-se media înălţimilor picului sau ariile soluţiilor de calibrare (etalonare) ca ordonate şi concentraţiile corespondente în mg/ml, ca abscise.
  3. 5.6.3. Soluţia probă
    
    Se injectează extractul de probă (5.3.2) de mai multe ori, utilizându-se acelaşi volum folosit pentru soluţiile de calibrare (etalonare) şi se determină media înălţimilor picurilor (ariilor) de metil benzoat
6. Calcularea rezultatelor

Se determină concentraţia soluţiei din probă a soluţiei din probă în mg/ml pornindu-se de la media înălţimii (ariei) picurilor de metil benzoat a soluţiei din probă în raport cu curba de etalonare.(5.4.2).

Conţinutul în metil benzoat al probei w (mg/ml) este dat de următoarea formulă:

cx40

w=-

m

În care:

c = concentraţia în metil benzoat a probei, în mg/ml, m = masa probei de testat exprimată în g
7. Validarea rezultatelor
1. 7.1. Identitate
  
  Identitatea produsului analizat poate fi confirmată prin co cromatografie sau prin utilizarea unui detector cu sistem de diode prin care sunt comparate spectrul extractului probei şi soluţia de etalonare (3.7.2) ce conţine 6 mg/ml.
  1. 7.1.1. Co – cromatografia
    
    Un extract de probă este îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi corespunzătoare din soluţia de etalonare (3.9.3). Cantitatea de metil benzoat adăugată trebuie să fie similară cu cantitatea estimată de metil benzoat în extractul de probă.
    
    Numai înălţimea picului de metil benzoat trebuie să crească după luarea în calcul a ambelor cantităţi adăugate şi diluarea extractului. Lărgimea picului, la jumătate din înălţimea maximă, trebuie să se încadreze în maxim 10%> din lărgimea init,ială.
    
    7.1.2Detectare prin sistemul de diode
    
    Rezultatele sunt evaluate în conformitate cu următoarele criterii:
    1. (a) lungimea de undă a absorbţiei maxime a probei şi a spectrelor standardului (etalonului), înregistrate pe cromatogramă la vârful picului, trebuie să fie aceeaşi, cu o zonă de siguranţă determinată prin puterea de
      
      rezolutie a sistemului de detectare. Pentru detectare prin si'stemul de diode , aceasta este tipică până la
      
      aproximativ 2 nm.
    2. (b) între 220 şi 350 nm, spectrele probei şi a etalonului, înregistrate pe cromatogramă la vârful picului, nu trebuie să fie diferite pentru acele părţi ale spectrului cuprinse între 1O şi 100% ale absorbţiei relative. Acest criteriu este îndeplinit când sunt prezente aceleaşi
2. 7.2.
3. 7.3.
8.

maxime şi când nu se observă vreo deviaţie între cele două puncte ale spectrului ce depăşeşte 15% din proba de analizat standard.

(c) între 220 şi 350 nm, spectrul curbei ascendente, a vârfului şi a curbei descendente a picului produs de extractul de probă, nu trebuie să fie diferită unele de celelalte, pentru acele părţi ale spectrului în interiorul gamei de la 1O la 100% de absorbţie relativă. Acest criteriu este îndeplinit când sunt prezente aceleaşi maxime şi când la toate punctele observate deviaţia dintre spectre nu depăşeşte 15% din absorbţia spectrului vârfului.

Dacă unul din aceste criterii nu este îndeplinit, prezenţa substantei de analizat nu este confirmată

Repetab'ilitate

Diferenţa între rezultatele a 2 determinări paralele efectuate pe aceleaşi probe nu trebuie să depăşească

10°/o din cel mai mare rezultat al continutului în metil benzoat, intre 4 si 20 mg/kg. '

Randament

Pentru o probă martor îmbogăţită, randamentul trebuie să fie de minim 90%.

Rezultate ale unui studiu de colaborare

Cinci probe au fost analizate de către 1O laboratoare. Au fost efectuate analize duble pentru fiecare probă.

Rezultate

Media	n.d	4,50	4,50	8,90	8,70
Sr (mg/kg}		0,30	0,20	0,60	0,50
CVr (%)		6,70	4,40	6,70	5,70
Sr (mg/kg)		0,40	0,50	0,90	1,00
CVR (%}		8,90	11,1O	10,10	11,50
Randament	–	93,00	92,00	89,00
(%)	92,00

n.d. = nedetectat

Sr = deviaţia standard a repetabilităţii

CVr= coeficientul de deviaţie a repetabilităţii SR= deviaţia standard a reproductibilităţii CVR=coeficient de variaţie a reproductibilităţii

AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR

O R D I N

pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește o metodă națională de analiză pentru determinarea lasalocidului de sodiu din furaje*)

Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia,

văzând Referatul de aprobare nr. 153.190 din 26 mai 2004 al Direcției generale veterinare,

președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin:

Art. 1. — Se aprobă Norma veterinară ce stabilește o metodă națională de analiză pentru determinarea lasalocidului de sodiu din furaje, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art. 2. — Institutele centrale de profil, direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a

municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Art. 3. — Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin.

Art. 4. — Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor,

Liviu Harbuz

București, 10 iunie 2004.

Nr. 24.

*) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 24/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis.

**) Anexa este reprodusă în facsimil.

ANEXĂ

NORMĂ VETERINARĂ

ce stabilește o metodă națională de analiză pentru determinarea lasalocidului de sodiu din furaje

ANEXĂ

la norma veterinară

Se transferă 5,0 ml de acid clorhidric (3.6) într-un balon gradat de 1OOO ml, se aduce la semn cu metanol (3.5) şi se amestecă. Această soluţie trebuie să fie proaspăt preparată înainte de utilizare.

3.9. Fază mobilă pentru HPLC, soluţie tampon de fosfat şi metanol 5 + 95 (V + V)

Se amestecă 5 ml de soluţie tampon de fosfat (3.7) cu 95 ml de metanol (3.5).

3.1O. Substanţă etalon lasalocid de sodiu cu puritate

garantată, C34H5308Na (sare sadică de polieter a acidului monocarboxilic, produs de Streptomyces lasaliensis), E763

3.10.1. Solutie mamă din etalon de lasalocid de sodiu, 500

µg/ml

'

Se cântăresc cu o precizie de O,1 mg, 50 mg de

lasalocid de sodiu (3.1O) într-un balon gradat de 100 ml, se dizolvă în metanol acidifiat (3.8), se aduce la semn cu acelaşi solvent şi se amestecă. Această soluţie trebuie să fie proaspăt preparată înainte de utilizare.
3.10.2. Solutie etalon intermediară de lasalocid de sodiu,

50 µg/ml '

Se pipetează 10,0 ml de soluţie mamă din etalon (3.10.1) într-un balon gradat de 100 ml, se aduce la semn cu metanol acidifiat (3.8) şi se amestecă. Soluţia trebuie să fie proaspăt preparată înainte de utilizare.
3.10.3. Solutii de etalonare

Se transferă 1,'0, 2,0, 4,0, 5,0 şi 10,0 ml din soluţia etalon

intermediară (3.10.2) într-o serie de baloane gradate de 50 ml. Se aduce la semn cu metanol acidifiat (3.8) şi se amestecă. Aceste soluţii corespund respectiv la 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 şi 10,0 µg de lasalocid de sodiu pe ml. Aceste soluţii trebuie să fie proaspăt preparate înainte de utilizare.

3.11. Apă, de calitate HPLC

4. ·Aparatură
1. 4.1. Baie cu ultrasunete (sau baie de apă cu agitator) cu reglaj de temperatură
2. 4.2. Filtre cu membrană de 0,45 µm
3. 4.3. Echipament HPLC cu sistem de injecţie, corespunzător pentru injectarea de volume de 20 de µI
  1. 4.3.1. Coloană pentru cromatografie lichidă de 125 mm x 4 mm, în fază inversă C18, umplere de 5 µm sau echivalentă
  2. 4.3.2. Spectrofluorimetru cu ajustarea lungimilor de undă variabile a lungimilor de undă de excitaţie şi emisie
5. Procedură
1. 5.1. Generalităti
  1. 5.1.1. Furaj ma'rtor
    
    Pentru efectuarea testului de recuperare (5.1.2), trebuie analizat un furaj martor pentru a se verifica faptul că nu este prezent lasalocid de sodiu sau substanţe interferente. Furajul martor trebuie să fie de tip similar cu cel al probei şi nu trebuie
    
    să fie detectate lasalocidul de sodiu sau substantele
    
    intereferente. '
  2. 5.1.2. Test de recuperare
    
    Trebuie efectuat un test de recuperare prin analizarea furajului martor ce a fost îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de lasalocid de sodiu, similară celei prezente în probă. Pentru a se fortifica la un nivel de 100 mg/kg, se transferă 10,0 ml din soluţia mamă din etalon (3.10.1) într-un balon conic de 250 ml şi se evaporă soluţia până la aproximativ 0,5 ml. Se adaugă 50 g de furaj martor, se amestecă cu grijă şi se lasă timp de 1O minute, amestecând din nou de mai multe ori înainte de a se continua cu faza de extracţie (5.2).
    
    Alternativ, dacă un furaj martor de tip similar cu cel al probei nu este disponibil (vezi 5.1.1), poate fi efectuat un test de recuperare prin intermediul metodei de adăugare de etalon. în acest caz, proba ce trebuie analizată este îmbogăţită cu o cantitate de lasalocid de sodiu, similară celei deja prezente în probă. Această probă este analizată împreună cu proba neîmbogăţită iar recuperarea calculată prin diferenţă.
2. 5.2. Extractia
  
  5.2.1-. Furaj'e
  
  Se cântăresc cu precizie de 0,01 g, între 5 g şi 1O g de probă într-un balon conic de 250 ml cu dop. Se adaugă prin pipetare 100,0 ml de metanol acidifiat (3.8). Se astupă lejer şi se agită pentru a se dispersa. Se plasează balonul într-o baie cu ultrasunete (4.1) la aproximativ 40 °C timp de 20 de minute, apoi se scoate şi se răceşte la temperatura camerei. Se lasă să
  
  stea aproximativ 1 oră până ce s-au decantat materiile în suspensie, apoi se filtrează o parte alicotă printr-un filtru cu membrană de 0.45 µm (4.2) într-un vas corespunzător. Se continuă cu determinarea HPLC (5.3).
  
  5.2.2. Premixuri
  
  Se cântăresc cu precizie de 0,001 g aproximativ 2 g de premix nemărunţit într-un balon gradat de 250 ml. Se adaugă 100,0 ml de metanol acidifiat (3.8) şi se agită pentru a se dispersa. Se plasează balonul şi conţinutul într-o baie cu ultrasunete (4.1), la aproximativ 40 °C, timp de 20 de minute, apoi se scoate şi se răceşte la temperatura camerei. Se diluează până la semn cu metanol acidifiat (3.8) şi se amestecă cu grijă. Se lasă să stea timp de o oră până se decantează materiile în suspensie, apoi se filtreaază o parte alicotă printr-un filtru cu membrană de 0,45 µm (4.2). Se diluează un volum corespunzător de filtrat clar cu metanol acidifiat (3.8), pentru a se obţine o soluţie de testare finală ce conţine aproximativ 4 µg/ml de lasalocid de sodiu. Se continuă cu determinarea HPLC (5.3).
3. 5.3. Determinarea HPLC
  1. 5.3.1. Parametri
    
    Următoarele condiţii sunt oferite spre orientare; pot fi utilizate alte conditii cu conditia ca acestea să dea rezultate
    
    echivalente: ' '
    
    Coloană cromatografică lichidă (4.3.1): 125 mm x 4 mm, în fază inversă C18, umplere de 5 µm sau echivalentă
    
    Fază mobilă (3.9): Amestec de soluţie tampon de fosfat (3.7) şi metanol (3.5), 5 + 95 (V + V)
    
    Debit: 1,2 ml/min
    
    Lungimea undei de detecţie:
    - – Excitatie: 310 nm
    - – Emisie': 419 nm
    Volum de injecţie: 20 µI
    
    Se verifică stabilitatea sistemului cromatografic, injectându-se de mai multe ori soluţia de etalonare (3.10.3) ce conţine 4.0 µg/ml, până când sunt obţinute înălţimi (sau arii) ale picului şi timpi de retenţie constanţi.
  2. 5.3.2. Curbă de etalonare
    
    Se injectează fiecare soluţie de etalonare (3.10.3) de mai multe ori şi se determină înălţimile (ariile) medii ale picului, pentru fiecare concentraţie. Se stabileşte o curbă de etalonare utilizând înălţimile (ariile) medii ale picului ca ordonate şi concentraţiile corespondente în µg/ml ca abcise.
  3. 5.3.3. Soluţia probei
    
    Se injectează extractul probei (5.2.1 sau 5.2.2) de mai multe ori, utilizând acelaşi volum ca cel reţinut pentru soluţia de etalonare şi se determină înălţimile (ariile) medii ale picului lasalocidului de sodiu.
6. Calcularea rezultatelor

Plecând de la înălţimea (aria) medie a picului produsă prin injectarea soluţiei probei (5.3.3), se determină concentraţia de lasalocid de sodiu (µg/ml) prin raportare la curba de etalonare.
1. 6.1. Furaje
  
  Conţinutul în lasalocid de sodiu, w (mg/kg) din probă este dat de următoarea formulă:
  
  w = /3.V, [mg I kg]
  
  m
  
  unde:
  
  ţ3 = conţinutul în lasalocid de sodiu al soluţiei probei (5.2.1) în µg/ml
  
  V1 = volumul extractului probei, în conformitate cu 5.2.1 în ml (de ex. 100)
  
  m = masa părţii de test, în g
2. 6.2. Premixuri
  
  Conţinutul în lasalocid de sodiu, w(mg/kg) din probă este dat de următoarea formulă:
  
  w= /3.V2.f[mg lk g]
  
  m
  
  unde:
  
  ţ3 = concentraţia de lasalocid de sodiu a soluţiei probei (5.2.2) în µg/ml
  
  V2 = volumul extraxtului probei, în conformitate cu 5.2.2 în ml
  
  (de ex. 250)
  
  f = factor de dilutie, în conformitate cu 5.2.2
  
  m = masa părţii d' e test în g
7. Validarea rezultatelor
1. 7.1. Identitate
  
  Metodele bazate pe spectrofluorimetrie sunt mai puţin supuse interferenţei decât cele la care este utilizată detecţia UV. Identitatea substanţei de analizat poate fi confirmată prin co-cromatografie.
  1. 7.1.1. Co-cromatografie
    
    Un extract al probei (5.2.1 sau 5.2.2) este îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi corespunzătoare din soluţia de etalonare (3.10.3). Cantitatea de lasalocid de sodiu adăugată trebuie să fie similară cu cantitatea de lasalocid de sodiu constatată în extractul probei. Numai înălţimea picului lasalocidului de sodiu trebuie să fie mai mare într-o măsură ce este corelată cu cantitatea de lasalocid de sodiu adăugată şi diluţia extractului. Lărgimea picului la jumătatea înălţimii trebuie să se situeze la ± 1O % de lărgimea iniţială a picului produsă de extractul probei ne-îmbogăţite.
2. 7.2. Repetabilitate
  
  Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe aceeaşi probă nu trebuie să depăşească:
  - – 15 % cu referire la valoarea maximă pentru conţinutul în lasalocid de sodiu de la 30 mg/kg la 100 mg/kg,
  - – 15 mg/kg pentru conţinutul în lasalocid de sodiu de la 100 mg/kg la 200 mg/kg,
  - – 7,5 % cu referire la valoarea maximă pentru un conţinut în
  lasalocid de sodiu mai mare de 200 mg/kg.
3. 7.3. Recuperare
  
  Pentru proba de furaj (martor) îmbogăţită, recuperarea trebuie să fie de cel puţin 80 %. Pentru probele de premIx îmbogăţite, recuperarea trebuie să fie de cel puţin 90 °/o.
8. Rezultatele unui studiu de colaborare

A fost organizat un studiu de colaborare în care 2 probe de premixuri (probele 1 şi 2) şi 5 probe de furaje (probele 3-7) au fost analizate de 12 laboratoare. Pentru fiecare probă au fost efectuate analize duble. Rezultatele sunt date în următorul tabel:

	Proba 1 Premix pui	Proba 2 Premix curci	Proba 3 Pelete curci	Proba 4 Granule pui	Proba 5 Furaj curci	Proba 6 Furaj A păsări	Proba 7 Furaj B păsări
L	12	12	12	12	12	12	12
N	23	23	23	23	23	23	23
Medie (mg/kg)	5 050	16 200	76,5	78,4	92,9	48,3	32,6
Sr (mg/kg)	107	408	1,71	2,23	2,27	1,93	1,75
Cvr(%)	2,12	2,52	2,24	2,84	2,44	4,00	5,37
SR(mg/kg)	286	883	3,85	7,32	5,29	3,47	3,49
CVR(%)	5,66	5,45	5,03	9,34	5,69	7,18	10,70
Cont,inut nominal	5 OOO*	16 OOO*	80*	105*	120*	50+	35+
(mg/kg)

L: număr laboratoare

n: număr rezultate unice

Sr: deviaţie standard a repetabilităţii

SR: deviaţie standard a reproductibilităţii CVr: coeficient de variaţie a repetabilităţii, %

CVR: coeficient de variaţie a reproductibilităţii, %

* continut declarat de fabricant

+ fura'j preparat în laborator

AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR

O R D I N

pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește metode naționale de analiză pentru determinarea produselor amprolium, diclazuril și carbadox din furaje*)

Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia,

văzând Referatul de aprobare nr. 153.880 din 25 mai 2004 al Direcției generale veterinare,

președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor, emite următorul ordin:

Art. 1. — Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metode naționale de analiză pentru determinarea produselor amprolium, diclazuril și carbadox din furaje, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art. 2. — Institutele centrale de profil, direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a

municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Art. 3. — Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin.

Art. 4. — Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor,

Liviu Harbuz

București, 10 iunie 2004.

Nr. 25.

*) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 25/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis.

**) Anexa este reprodusă în facsimil.

ANEXĂ

NORMĂ VETERINARĂ

ce stabilește metode naționale de analiză pentru determinarea produselor amprolium, diclazuril și carbadox din furaje

ANEXĂ

la norma veterinară

membrană de 0,22 µm (4.3) şi se degazează soluţia (de ex. în baia cu ultrasunete (4.4) timp de cel puţin-15 minute.

3.7. Substanţă etalon: amprolium pur, clorhidrat clorură de 1-[(4-amino-2-propil-5-pirimidin)metil]-2-metil-piridinium, E 750

(vezi 9.2).
1. 3.7.1. Soluţie etalon stoc de amprolium, 500 µg/ml
  
  Se cântăresc cu o precizie de O,1 mg, 50 mg de amprolium (3.7) într-un balon gradat de 100 ml, se dizolvă în 80 ml de metanol (3.1) şi se plasează balonul timp de 1O min într-o baie cu ultrasunete (4.4). După tratament cu ultrasunete, se
  
  aduce soluţia la temperatura camerei, se aduce la semn cu apă şi se omogenizeaza. La o temperatură de 4 °e, soluţia este stabilă timp de o lună.
2. 3.7.2. Soluţie etalon intermediară de amprolium, 50 µg/ml Se pipetează 5 ml din soluţia etalon stoc (3.7.1) într-un
  
  balon gradat de 50 ml, se aduce la semn cu solvent de extracţie (3.8) şi se omogenizeaza. La o temperatură de 4 °e, soluţia este stabilă timp de o lună.
3. 3.7.3. Solutii de etalonare
  
  Se transfer'ă 0,5, 1 şi 2 ml din soluţia etalon intermediară
  
  (3.7.2) într-o serie de baloane gradate de 50 ml. Se aduce la semn cu faza mobilă (3.6) şi se omogenizeaza. Aceste soluţii corespund la 0,5, 1 şi respectiv 2 µg de amprolium pe ml. Aceste soluţii trebuie să fie proaspăt preparate înainte de utilizare.
3.8. Solvent de extractie

Amestec de metanol (3' .1) şi apă 2+1 (v+v).

4. Aparatură
1. 4.1. Echipament HPLC cu sistem de injecţie, corespunzător injectării de volume de 100 µI.
  1. 4.1.1. Coloană pentru cromatografie lichidă de 125 mm x 4 mm cu schimbători de cationi, umplere de Nucleosil 1O SA de 1O µm sau echivalentă.
  2. 4.1.2. Detector UV cu lungime de undă variabilă sau detector cu grup de diode.
2. 4.2. Filtru cu membrană, material PTFE, de 0,45 µm.
3. 4.3. Filtru cu membrană de 0,22 µm. –
4. 4.4. Baie cu ultrasunete.
5. 4.5. Agitator mecanic sau magnetic.
5. Procedură
1. 5.1. Generalităti
  1. 5.1.1. Furaj ma'rtor
    
    Pentru efectuarea testului de recuperare (5.1.2), trebuie analizat un furaj martor pentru a se verifica faptul că nu este prezent amprolium sau substanţe interferente. Furajul martor trebuie să fie de tip similar cu cel al probei şi nu trebuie să fie detectate amprolium sau substanţe interferente.
  2. 5.1.2. Test de recuperare
    
    Trebuie efectuat un test de recuperare prin analizarea furajului martor ce a fost îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de amprolium, similară celei prezente în probă. Pentru a se îmbogăţi la un nivel de 100 mg/kg, se transferă 1O ml din soluţia etalon stoc (3.7.1) într-un pahar conic de 250 ml şi se evaporă soluţia până la aproximativ 0,5 ml. Se adaugă 50 g de furaj martor, se amestecă cu grijă şi se lasă timp de 1O minute, amestecând din nou de mai multe ori înainte de a continua cu faza de extracţie (5.2).
    
    Alternativ, dacă nu este disponibil un furaj martor de tip similar celui din probă (a se vedea 5.1.1), poate fi efectuat un test de recuperare prin intermediul metodei de aditie a
    
    etalonului.
    
    Aln acest caz, proba de analizat este îmbogăţită‘
    
    cu o
    
    cantitate de amprolium similară celei deja prezente în probă. Această probă este analizată împreună cu proba ne-îmbogăţită, iar recuperarea poate fi calculată prin diferenţă.
2. 5.2. Extractie
  1. 5.2.1. Prem' ixuri (conţinut de amprolium <1 %) şi furaje
    
    Se cântăresc cu o precizie de 0,01 g, între 5 şi 40 g de probă, în funcţie de conţinutul în amprolium, într-un pahar conic de 500 ml şi se adaugă 200 ml de solvent de extracţie (3.8). Se plasează balonul în baia cu ultrasunete (4.4) şi se lasă timp de 15 minute. Se scoate balonul din baia cu ultrasunete şi se agită timp de o oră cu agitatorul mecanic sau cu agitatorul magnetic (4.5). Se diluează o parte alicotă a extractului cu faza mobilă (3.6) pentru un conţinut în amprolium de 0,5- 2 µg/ml şi se amestecă (vezi observaţia 9.3). Se filtrează 5-1O ml din această
    
    soluţie diluată printr-un filtru cu membrană (4.2). Se continuă cu determinarea HPLC (5.3).
  2. 5.2.2. Premixuri (conţinut 1 % amprolium)
    
    Se cântăresc cu o precizie de 0,001 g, 1-4 g de premix, în funcţie de conţinutul în amprolium, într-un pahar conic de 500 ml şi se adaugă 200 ml de solvent de extracţie (3.8). Se plasează balonul în baia cu ultrasunete (4.4) şi se lasă timp de 15 minute. Se scoate balonul din baia cu ultrasunete şi se agită timp de o oră cu agitatorul mecanic sau cu agitatorul magnetic (4.5). Se diluează o parte alicotă a extractului cu faza mobilă (3.6), pentru un conţinut în amprolium de 0,5-2 µg /ml şi se amestecă. Se filtrează 5-1O ml din această soluţie diluată printr un filtru cu membrană (4.2). Se continuă cu determinarea HPLC (5.3).
3. 5.3. Determinarea HPLC
  1. 5.3.1. Parametri:
    
    Sunt oferite pentru orientare următoarele condiţii; pot fi utilizate alte conditii numai dacă acestea dau rezultate
    
    echivalente. '
    
    Coloană cromatografică lichidă (4.1.1.): 125 mm x 4 mm, cu
    
    schimbători de cationi, umplere de Nucleosil 1O SA de 1O µm sau echivalentă.
    
    Fază mobilă (3.6): Amestec de acetonitril (3.2),
    
    soluţie de fosfat dihidrogenat de sodiu (3.4) şi soluţie de perclorat de sodiu (3.5), 450 + 450 + 100
    
    (v+v+v)
    
    Debit: O,7-1 ml/min.
    
    Lungimea undei de detecţie: 264 nm. Volum de injecţie: 100 µI.
    
    Se verifică stabilitatea sistemului cromatografic injectând de mai multe ori soluţia de etalonare (3.7.3) conţinând 1,0 µg/ml, până la obţinerea de înălţimi ale picului şi timpi de retentie constanti.
    
    ' '
  2. 5.3.2. Curbă de etalonare
    
    Se injectează fiecare soluţie de etalonare (3.7.3) de mai multe ori şi se determină înălţimile (ariile) medii ale picului pentru fiecare concentraţie. Se stabileşte o curbă de etalonare utilizând înălţimile (ariile) medii ale picului ale soluţiilor de etalonare ca ordonate şi concentraţiile corespondente, în µg/ml, ca abcise.
  3. 5.3.3. Soluţia probei
    
    Se injectează extractul din probă (5.2) de mai multe ori, utilizând acelaşi volum ca cel utilizat pentru soluţiile de etalonare şi se determină înălţimea (aria) medie a picului pentru amprolium.
6. Calculul rezultatelor

Plecând de la înălţimea (aria) medie a picurilor pentru amprolium a soluţiei din probă, se determină concentraţia soluţiei probei în µg/ml, prin referire la curba de etalonare (5.3.2).

Conţinutul probei în amprolium w, în mg/kg, este dat de următoarea formulă:

w=V–xo–xmf [ glkg]

m

în care:

V = volumul solventului de extracţie (3.8) în ml, conform 5.2 (adică 200 ml)

o = concentraţia de amprolium din extractul din probă (5.2) în µg/ml

f = factorul de dilutie conform 5.2 m = masa porţiunii' de test în g
7. Validarea rezultatelor
Rezultatele sunt evaluate în conformitate cu următoarele criterii:
1. a) Lungimea de undă a absorbţiei maxime a spectrelor probei şi a etalonului, înregistrată la vârful picului pe cromatogramă, trebuie să fie aceeaşi într-o marjă determinată de puterea de rezoluţie a sistemului de detecţie. Pentru detecţia cu grupuri de diode, aceasta este în general de +2 nm.
2. b) Între 21O şi 320 nm, spectrele probei şi ale etalonului, înregistrate la vârful picului cromatogramei nu trebuie să fie diferite pentru acele părţi ale spectrului situate între 1O şi 100 % din absorbanţa relativă. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt prezente aceleaşi maxime şi la nici un punct observat deviaţia dintre două spectre nu depăşeşte 15°/o din absorbanţa etalonului substantei de analizat;
3. c) IA ntre 21O ş' i 320 nm, spectrele porţiunii ascendente, ale vârfului şi ale porţiunii descendente a picului produse de extractul din probă, nu trebuie să fie diferite unele de altele pentru acele părţi ale spectrului situate între 1O şi 100 % din absorbanţa relativă. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt prezente aceleaşi maxime şi când la toate punctele observate deviaţia dintre spectre nu depăşeşte 15 % din absorbanţa spectrului vârfului picului. Dacă unul din aceste criterii nu este îndeplinit, prezenţa substanţei de analizat nu este confirmată.
7.2. Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe aceeaşi probă nu trebuie să depăşească
1. a) 15 % din valoarea superioară, pentru un conţinut în amprolium între 25 mg/kg şi 500 mg/kg
2. b) 75 mg/kg pentru un conţinut în amprolium între 500 mg/kg şi 1OOO mg/kg
3. c) 7,5 % din valoarea superioară, pentru un conţinut în amprolium mai mare de 1OOO mg/kg.
7.3. Recuperare

Pentru o probă (martor) îmbogăţită, recuperarea trebuie să fie de cel puţin 90%.

8. Rezultatele unui studiu de colaborare

A fost organizat un studiu de colaborare, în cursul căruia au fost analizate trei furaje pentru păsări (probe 1-3), un furaj mineral (proba 4) şi un premix (proba 5). Rezultatele sunt prezentate în următorul tabel

Proba 1 (furaj

martor)

Proba 2

Proba 3

Proba 4

Proba 5

n medie (mg/kg)

St (mg/kg) CVt(%)

SR (mg/kg)

CVR (%)

–

45,5

2,26

4,95

2,95

6,47

188

3,57

1,90

11,8

6,27

5129

178

3,46

266

5,19

25140

550

2,20

760

3,00

Continut nomi'nal

(mg/kg)

–

200

5000

25000

L: număr de laboratoare n: număr de valori unice

St: deviaţie standard a repetabilităţii

CVt: coeficient de variaţie a repetabilităţii SR: deviaţie standard a reproductibilităţii

CVR: coeficient de variatie a reproductibilitătii

9. Observatii

9.1 Dacă ' proba conţine tiamină, picul tiaminei din

cromatogramă apare puţin înainte de picul amprolium-ului. Potrivit acestei metode, amprolium-ul şi tiamina trebuie să fie separate. Dacă amprolium-ul şi tiamina nu sunt separate de coloana (4.1.1) utilizată în această metodă, se înlocuieşte cu metanol până la 50 % din partea de acetonitril a fazei mobile (3.6).
9.2 Conform Farmacopeii Britanice, spectrul soluţiei de amprolium (c = 0,02 mol/I) în acid clorhidric (c = O,1 mol/I) prezintă maxime la 246 nm şi 262 nm. Absorbanţa va fi de 0,84 la 246 nm şi de 0,80 la 262 nm.

PARTEA B DETERMINAREA DICLAZURILULUI

2,6 – diclor-(4-clorofenil)-4-[2,3,4,5-tetrahidro-3,5-dioxo-1,2,4- triazin-2-yl]fenil-acetonitril

1. Scop şi domeniu de aplicare

Metoda permite determinarea diclazurilului din furaje şi premixuri. Limita de detecţie este de O,1 mg/kg iar limita de determinare este de 0,5 mg/kg.
2. Principiu

După adiţia unui etalon intern, proba este extrasă cu metanol acidifiat. Pentru furaje, o parte alicotă a extractului este purificată pe un cartuş C18 pentru extracţie în fază solidă. Diclazurilul este eluat din cartuş cu un amestec de metanol acidifiat şi apă. După evaporare, reziduul este dizolvat în DMF/apă. Pentru premixuri, extractul este evaporat iar reziduul este dizolvat în DMF/apă. Conţinutul în diclazuril este determinat prin cromatografie în fază lichidă de înaltă performanţă (HPLC) cu gradient ternar şi în fază inversă, utilizând un detector UV.
3. Reactivi
1. 3.1. Apă, de grad HPLC.
2. 3.2. Acetat de amoniu.
3. 3.3. Hidrogenosulfat de tetrabutilamoniu (TBHS).
4. 3.4. Acetonitril, de grad HPLC.
5. 3.5. Metanol, de grad HPLC.
6. 3.6. N,N-dimetilformamidă (DMF).
7. 3.7. Acid clorhidric, d20 = 1,19 g/ml.
8. 3.8. Substanţă etalon: diclazuril 11-24: [2,6 dicloro-(4- clorofenil)-4-(2,3,4,5-tetrahidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl) fenil]-acetonitril, cu puritate garantată, E771.
  1. 3.8.1. Soluţie etalon stoc de diclazuril, 500 µg/ml.
    
    Se cântăresc, cu o precizie de O,1 mg, 25 mg de substanţă etalon de diclazuril (3.8) într-un balon gradat de 50 ml. Se dizolvă în DMF (3.6), se aduce la semn cu DMF (3.6) şi se omogenizeaza. Se împachetează balonul într-o foaie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare bruna şi se depozitează în frigider. La o temperatură de 4 °e, soluţia este stabilă timp de o lună.
  2. 3.8.2. Soluţie etalon de diclazuril, 50 µg/ml.
    
    Se transferă 5,00 ml din soluţia etalon stoc (3.8.1) într-un balon gradat de 50 ml, se aduce la semn cu DMF (3.6) şi se omogenizeaza. Se împachetează balonul într-o folie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare bruna şi se depozitează în frigider. La o temperatură de 4 °e, soluţia este stabilă timp de o lună.
9. 3.9. Substanţă etalon internă: 2,6 dicloro-a-(4-chlorofenil}- 4-(4,5 dihidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazină-2 (3H}-yl} a-metilbenzen acetonitril.
  1. 3.9.1. Soluţie etalon stoc internă, 500 µg/ml.
    
    Se cântăresc, cu o precizie de O,1 ml, 25 mg de substanţă etalon internă (3.9) într-un balon gradat de 50 ml. Se dizolvă în DMF (3.6), se aduce la semn cu DMF (3.6) şi se omogenizeaza. Se împachetează balonul într-o folie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare bruna şi se depozitează în frigider. La o temperatură de 4 °e, soluţia este stabilă timp de o lună.
  2. 3.9.2. Soluţie etalon internă, 50 µg/ml. Se transferă 5,00 ml din soluţia etalon stoc internă (3.9.1) într-un balon gradat de 50 ml, se aduce la semn cu DMF (3.6) şi se omogenizeaza. Se împachetează flaconul într-o folie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare bruna şi se depozitează în frigider. La o temperatură de 4 °e, la soluţia este stabilă timp de o lună.
  3. 3.9.3. Soluţie etalon internă pentru premixuri, p/1000 mg/ml (p = conţinut nominal în diclazuril al premixului în mg/kg). Se cântăresc, cu o precizie de O,1 mg, 1O mg de substanţă
    
    etalon internă într-un balon gradat de 100 ml, se dizolvă în DMF (3.6) într-o baie cu ultrasunete (4.6), se aduce la semn cu DMF şi se omogenizeaza. Se împachetează flaconul într-o folie de aluminiu sau se utilizează un flacon de culoare bruna şi se depozitează în frigider. La o temperatură de 4 °C, soluţia este stabilă timp de o lună.
    
    3.1O. Soluţie de etalonare, 2 µg/ml.
    
    Se pipetează 2,00 ml de soluţie etalon de diclazuril (3.8.2) şi 2,00 ml de soluţie etalon internă, (3.9.2) într-un balon gradat de 50 ml. Se adaugă 16 ml de DMF (3.6), se aduce la semn cu apă şi se omogenizeaza. Această soluţie trebuie să fie proaspăt preparată înainte de utilizare.
4. Aparatură
1. 4.1. Agitator mecanic.
2. 4.2. Echipament pentru HPLC cu gradient ternar.
  1. 4.2.1. Coloană pentru cromatografie lichidă, umplere de Hypersil ODS de 3 µm, 100 mm x 4,6 mm, sau echivalent.
  2. 4.2.2. Detector UV cu lungime de undă variabilă sau detector cu grup de diode.
3. 4.3. Evaporator rotativ în vid.
5. Procedură
1. 5.1. Generalităti
  
  '
  1. 5.1.1. Furaj martor
    
    Un furaj martor trebuie să fie analizat pentru a se controla faptul că nu sunt prezente nici diclazuril şi nici substanţe interferente. Furajul martor trebuie să fie de tip similar cu proba şi la analiză nu trebuie să fie detectate diclazuril sau substanţe interferente.
  2. 5.1.2. Test de recuperare
    
    Trebuie să fie efectuat un test de recuperare, prin analizarea furajului martor ce a fost îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de diclazuril similară celei prezente în probă. Pentru a se îmbogăţi la un nivel de 1 mg/kg, se adaugă O,1 ml din soluţia etalon stoc (3.8.1) la 50 g dintr-un furaj martor, se amestecă cu grijă şi se lasă timp de 1O minute, amestecând din nou de mai multe ori înainte de procedeu (5.2).
    
    Alternativ, dacă un furaj martor de tip similar probei nu este disponibil (vezi 5.1.1), poate fi efectuat un test de recuperare prin intermediul metodei de adiţie a etalonului. În acest caz, proba ce urmează să fie analizată este îmbogăţită cu o cantitate de diclazuril similară celei deja prezente în probă. Această probă este analizată alături de proba ne-îmbogăţită, iar recuperarea poate fi calculată prin diferenţă.
2. 5.2. Extractie
  
  '
  1. 5.2.1. Furaje
    
    Se cântăresc, cu o precizie de 0,01 g, aproximativ 50 g din probă. Se transferă într-un pahar conic de 500 ml, se adaugă 1,00 ml din soluţia etalon internă (3.9.2), 200 ml solvent de extracţie (3.12) şi se astupă paharul. Se agită amestecul cu agitatorul (4.1) pe parcursul nopţii. Se lasă să se depună timp de 1O minute. Se transferă o parte alicotă de 20 ml din
    
    supernatant într-un recipient de sticlă corespunzător şi se diluează cu 20 ml de apă. Se transferă această soluţie într-un cartuş de extracţie (3.11) şi se trece prin vid (4.5). Se spală cartuşul cu 25 ml dintr-un amestec de solvent de extracţie (3.12) şi apă, 65 + 35 (V + V). Se elimină fracţiunile colectate şi se eluează compuşii cu 25 ml dintr-un amestec de solvent de extracţie (3.12) şi apă, 80 + 20 (V + V). Se evaporă această fracţiune până când aceasta ajunge la sec, prin intermediul evaporatorului rotativ (4.3) la 60 °C. Se dizolvă reziduul în 1,0 ml de DMF (3.6), se adaugă 1,5 ml de apă (3.1) şi se amestecă. Se filtrează printr-un filtru cu membrană (4.4). Se continuă cu determinarea HPLC (5.3).
  2. 5.2.2. Premixuri
    
    Se cântăreşte, cu o precizie de 0,001 g, aproximativ 1 g din probă. Se transferă într-un pahar conic de 500 ml, se adaugă 1,00 ml din soluţia etalon internă (3.9.3), 200 ml de solvent de extracţie (3.2), şi se astupă paharul. Se agită amestecul pe parcursul nopţii cu agitatorul (4.1). Se lasă să se depună timp de 1O minute. Se transferă o parte alicotă de 10000/p ml (p = conţinut nominal în diclazuril al premixului în mg/kg) din supernatant într-un balon cu fundul rotund de mărime adecvată. Se evaporă până când acesta ajunge la sec, sub presiune redusă la 60°C, prin intermediul evaporatorului rotativ (4.3). Se redizolvă reziduul în 10,0 ml de DMF (3.6), se adaugă 15,0 ml de apă (3.1) şi se omogenizeaza. Se continuă cu determinarea HPLC (5.3).
3. 5.3. Determinarea HPLC.
  1. 5.3.1. Parametri
    
    Sunt oferite spre orientare următoarele condiţii; pot fi utilizate alte conditii numai dacă acestea dau rezultate
    
    echivalente. '
    - – Coloană cromatografică100 mm x 4,6 mm, umplere de Hypersil ODS de 3 µm sau lichidă (4.2.1):
      
      echivalent
    - – Fază mobilă: Solvent A (3.13.1): Soluţie apoasă de acetat de amoniu şi hidrogenosulfat de tetrabutilamoniu
      
      Solvent B (3.13.2): acetonitril Solvent C (3.13.3): metanol
    - – Mod de eluţie: . – gradient linear
      - – condiţii iniţiale:A+B+C= 60+20+20 (v+v+v)
      - – după 1O minute, eluţia prin gradient timp de 30 min la A+B+C = 45+20+35 (v+v+v)
        
        Se clăteşte cu B timp de 1O minute.
    - – Debit: 1,5-2 ml/min
    - – Volum de injecţie: 20 µI
    - – Lungimea undei de detecţie: 280 µI
    Se verifică stabilitatea sistemului cromatografic, injectând de mai multe ori soluţia de etalonare (3.1O), conţinând 2 µg/ml,
    
    până când sunt obţinute înălţimi ale picului şi timpi de retenţie constanti.
    
    '
  2. 5.3.2. Solutie de etalonare
    
    '
    
    Se injectează 20 µI din soluţia de etalonare (3.1O) de mai
    
    multe ori şi se determină înălţimea (zona) medie a picului de diclazuril şi picurile etalonului intern.
  3. 5.3.3. Soluţia din probă
    
    Se injectează 20 µI din soluţia din probă (5.2.1. sau 5.2.2.) de mai multe ori şi se determină înălţimea (aria) medie a picului de diclazuril şi picurile etalonului intern.
6. Calculul rezultatelor
1. 6.1. Furaje
  
  Conţinutul probei în diclazuril w(mg/kg) este dat de următoarea formulă:
  
  '
  
  hd sxh; c <5d,cxl OV [ ]
  
  w= •x–mglkg
  
  hi,sxhd,c m
  
  unde
  
  hd,s = înălţimea (aria) picului de diclazuril în soluţia de probă (5.2.1.)
  
  hi,s = înălţimea (aria) picului etalonului intern în soluţia de probă (5.2.1.)
  
  hd,c = înălţimea (aria) picului de diclazuril în soluţia de etalonare
  
  (3.1O)
  
  hi,c = înălţimea (aria) picului etalonului intern în soluţia de etalonare (3.1O)
  
  5 d,c= concentraţia diclazurilului în soluţia de etalonare în µg/ml
  
  (3.1O}
  
  m = masa porţiunii de test în g
  
  V= volumul extractului probei conform 5.2.1 (de ex. 2,5 ml)
  
  6.2 Premixuri
  
  Conţinutul în diclazuril w (mg/kg) din probă este dat de formula:
  
  hd,sxh; c ad cx0,02Vxp[ ]
  
  W= 'X' /
  
  h;,sxhd,c m
  
  unde
  
  hd,c= înălţimea (aria) picului de diclazuril în soluţia de etalonare
  
  (3.1O)
  
  hi,c= înălţimea (aria) picului etalonului intern în soluţia de etalonare (3.1O)
  
  hd,s= înălţimea (aria) picului de diclazuril în soluţia probei (5.2.2)
  
  hi,s= înălţimea (aria) picului etalonului intern în soluţia probei (5.2.2.)
  
  8 d,c = concentraţia diclazurilului în soluţia de etalonare (3.1O) m = masa porţiunii de test în g
  
  V= volumul extractului probei conform 5.2.2 (de ex. 25 ml) p = conţinutul nominal de diclazuril în mg/kg din premix
7. Validarea rezultatelor
1. 7.1. Identitate
  
  Identitatea substanţei de analizat poate fi confirmată prin co-cromatografie sau utilizând un detector cu grup de diode prin care sunt comparate spectrele extractului din probă (5.2.1. sau 5.2.2.) şi ale soluţiei de etalonare (3.1O).
  1. 7.1.1. Co-cromatografie
    
    Un extract din probă (5.2.1 sau 5.2.2.) este îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi corespunzătoare din soluţia de etalonare (3.1O). Cantitatea de diclazuril adăugată trebuie să fie similară cu cantitatea de diclazuril constatată în extractul din probă.
    
    Numai înălţimea picului de diclazuril şi a picului etalonului intern ar trebui să crească după luarea în considerare atât a cantităţii adăugate cât şi a diluţiei extractului. Lărgimea picului, la jumătatea înălţimii sale, trebuie să se situeze la ±10%, din lărgimea iniţială a picului de diclazuril sau a picului etalonului intern al extractului din proba neîmbogăţită.
  2. 7.1.2. Detectare cu grup de diode
    
    Rezultatele sunt evaluate în conformitate cu următoarele criterii:
    1. a) Lungimea de undă de absorbţie maximă a spectrelor probei şi a etalonului, înregistrate la vârful picului pe cromatogramă, trebuie să fie aceeaşi, cu o marjă stabilită de puterea de rezoluţie a sistemului de detecţie. Pentru detecţia cu grup de diode, aceasta este în general de +2 nm.
    2. b) între 230 şi 320 nm, spectrele probei şi ale etalonului, înregistrate la vârful picului cromatogramei, nu trebuie să fie diferite pentru acele părţi ale spectrului situate între 1O şi 100 % din absorbanţa relativă. Acest criteriu este îndeplinit atunci când aceleaşi maxime sunt prezente şi când la nici un punct observat deviaţia între cele două spectre nu depăşeşte 15% din absorba,nta etalonului substan'tei de analizat.
    3. c) Între 230 şi 320 nm, spectrele porţiunii ascendente, ale vârfului şi ale porţiunii descendente ale picului produse de extractul probei nu trebuie să fie diferite unele de altele pentru acele părţi ale spectrului situate între 1O şi 100 °/o din
    absorbanţa relativă. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt prezente aceleaşi maxime şi când la toate punctele observate deviaţia între spectre nu depăşeşte 15% din absorbanţa spectrului vârful picului.
    
    Dacă unul din aceste criterii nu este îndeplinit, prezenţa substantei de analizat nu a fost confirmată.
    
    '
2. 7.2. Repetabilitate
  
  Diferenţa între rezultatele a două determinări paralele efectuate pe aceeaşi probă nu trebuie să depăşească:
  1. a) 30 % din valoarea superioară, pentru un conţinut în diclazuril situat între 0,5 şi 2,5 mg/kg
  2. b) 0,75 mg/kg pentru un conţinut în diclazuril situat între 2,5 şi 5 mg/kg
  3. c) 15 % din valoarea superioară, pentru un conţinut în diclazuril mai mare de 5 mg/kg.
3. 7.3. Recuperare
  
  Pentru o probă (martor) îmbogăţită, recuperarea trebuie să fie de cel puţin 80 %.

8. Rezultatele unui studiu de colaborare

A fost organizat un studiu de colaborare în care au fost analizate cinci probe de către 11 laboratoare. Aceste probe au constat în două premixuri; unul a fost amestecat cu o matrice organică (O 100) şi celălalt cu o matrice anorganică (A 100). Conţinutul teoretic este de 100 mg de diclazuril pe kg. Cele trei furaje amestecate pentru păsări au fost fabricate de trei producători diferiţi (NL) (LI/ZI/Kl). Conţinutul teoretic este de 1 mg de diclazuril pe kg. Laboratoarele au fost instruite să analizeze fiecare din probe o singură dată sau în dublu. (Informaţii mai detaliate cu privire la acest studiu de colaborare pot fi găsite în Jurnalul AOAC Internaţional, Volumul 77, nr. 6, 1994, pp. 1359 – 1361.) Rezultatele sunt date în tabelul următor:

	Proba 1 A 100	Proba 2 O 100	Proba 3 L 1	Proba 4 21	Proba 5 K1
L	11	11	11	11	6
n	19	18	19	19	12
Medie	100,8	103,5	0,89	1,15	0,89
St (mg/kg)	5,88	7,64	0,15	0,02	0,03
CVt(%) SR (mg/kg)	5,83 7,59	7,38 7,64	17,32 0,17	1,92 o,11	3,34 0,12
CVR (%)	7,53	7,38	18,61	9,67	13,65
Continut nomi'nal (mQ/kQ)	100	100	1	1	1
L: număr de laboratoare n: număr de valori unice St: deviaţie standard a repetabilităţii CVt: coeficient de variaţie a repetabilităţii SR: deviaţie standard a reproductibilităţii CVR: coeficient de variatie a reproductibilitătii

9. Observatii

Răspunsul diclazurilului trebuie să fi fost demonstrat în

prealabil ca fiind linear peste gama de concentraţii ce sunt măsurate.

Partea C DETERMINAREA CARBADOXULUI

Metil 3-(2-quinoxalinilmetilenă)carbazat N1,N4-dioxid

1. Scop şi domeniu de aplicare

Prezenta metodă este destinată determinării carbadoxului din furaje, premixuri şi preparate. Limita de detecţie este de 1 mg/kg. Limita de determinare este de 1O mg/kg.
2. Principiu

Proba este echilibrată cu apă şi extrasă cu metanol acetonitril. Pentru furaje, o porţiune alicotă a extractului filtrat este supusă purificarii pe o coloană de oxid de aluminiu. Pentru premixuri şi preparate, o porţiune alicotă a extractului filtrat este diluată la o concentraţie corespunzătoare cu apă, metanol şi acetonitril. Conţinutul în carbadox este determinat prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă (HPLC) în fază inversă, utilizând un detector UV.
3. Reactivi
1. 3.1. Metanol.
2. 3.2. Acetonitril, de grad HPLC.
3. 3.3. Acid acetic, w = 100 %.
4. 3.4. Oxid de aluminiu: neutru, grad de activitate I.
5. 3.5. Metanol-acetonitril 1 + 1 (v + v)
  
  Se amestecă 500 ml de metanol (3.1) cu 500 ml de acetonitril (3.2).
6. 3.6. Acid acetic 1O %.
  
  Se diluează 1O ml de acid acetic (3.3) cu apă până la 100
  
  ml.
7. 3.7. Acetat de sodiu, CH3COONa.
8. 3.8. Apă, de grad HPLC.
9. 3.9. Soluţie tampon de acetat, c = 0,01 mol/I, pH = 6,0
  
  Se dizolvă 0,82 g de acetat de sodiu (3.7) în 700 ml de apă (3.8) şi se ajustează pH-ul la 6,0 cu acid acetic (3.6). Se transferă într-un balon gradat de 1OOO ml, se aduce la semn cu apă (3.8) şi se omogenizeaza.
  
  3.1O. Fază mobilă pentru HPLC
  
  Se amestecă 825 ml de soluţie tampon de acetat (3.9) cu 175 ml de acetonitril (3.2). Se filtrează printr-un filtru de 0,22 µm (4.5) şi se degazează soluţia (de exemplu prin tratare cu ultrasunete timp de 1O minute.
  
  I
  700 (v + v)
  
  Se amestecă 300 ml de apă cu 700 ml din amestecul de metanol-acetonitril (3.5).
4. Aparatură
1. 4.1. Agitator de laborator sau magnetic.
2. 4.2. Hârtie de filtru din fibră de sticlă (Whatman GF/A sau echivalent).
3. 4.3. Coloană de sticlă (lungime de 300 – 400 mm, diametru intern de aproximativ 1O mm), cu frită de sticlă sinterizată şi valvă de evacuare.
  
  Notă: poate fi utilizată, de asemenea, o coloană de sticlă prevăzută cu un robinet sau o coloană de sticlă cu o extremitate efilată; în acest caz, un tampon mic de vată de sticlă este inserat la extremitatea inferioară şi se împinge utilizând o baghetă de sticlă.
4. 4.4. Echipament HPLC cu sistem de injecţie, adecvat pentru injectarea de volume de 20 µI.
  1. 4.4.1. Coloană pentru cromatografie lichidă: 300 mm x 4 mm, C18, umplere de 10 µm sau echivalentă.
  2. 4.4.2. Detector UV cu lungime de undă variabilă sau detector cu grup de diode ce funcţionează între 225 şi 400 nm.
5. 4.5. Filtru cu membrană de 0,22 µm.
6. 4.6. Filtru cu membrană de 0,45 µm.
7. 4.7. Baie cu ultrasunete.
5. Procedură

Notă: Carbadoxul este fotosensibil. Efectuati toate procedurile în lumină estompată sau utilizaţi sticlărie de' culoare

bruna sau sticlărie ambalată în folie de aluminiu.
1. 5.1. Generalităti
  
  '
  1. 5.1.1. Furaj martor
    
    Pentru efectuarea testului de recuperare (5.1.2), trebuie să fie analizat un furaj martor, pentru a se verifica faptul că nu sunt prezente nici carbadox şi nici substanţe interferente. Furajul martor trebuie să fie de tip similar cu proba şi la analiză nu trebuie detectate nici carbadox şi nici substanţe interferente.
  2. 5.1.2. Test de recuperare
    
    Trebuie efectuat un test de recuperare prin analizarea furajului martor (5.1.1) ce a fost îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de carbadox, similară celei prezente în probă. Pentru a se îmbogăţi la un nivel de 50 mg/kg, se transferă 5,0 ml din soluţia etalon stoc (3.11.1) într-un pahar conic de 200 ml. Se evaporă soluţia la aproximativ 0,5 ml într-un curent de azot. Se adaugă 1O g din furajul martor, se amestecă şi se aşteaptă timp de 1O minute înainte de continua cu faza de extracţie (5.2).
    
    Alternativ, dacă nu este disponibil un furaj martor de tip similar probei (vezi 5.1.1), poate fi efectuat un test de recuperare prin intermediul metodei de adiţie a etalonului. În acest caz, proba este îmbogăţită cu o cantitate de carbadox similară celei deja prezente în probă. Această probă este analizată împreună cu proba neîmbogăţită şi recuperarea poate fi calculată prin diferenţă.
2. 5.2. Extractia
  
  '
  1. 5.2.1. Furaje
    
    Se cântăresc, cu o precizie de 0,01 g, aproximativ 1O g din probă şi se transferă într-un pahar conic de 200 ml. Se adaugă 15,0 ml de apă, se amestecă şi se echilibrează timp de 5 minute. Se adaugă 35,0 ml de metanol-acetonitril (3.5), se astupă şi se agită timp de 30 de minute cu agitatorul mecanic sau cu agitatorul magnetic (4.1). Se filtrează soluţia printr-o hârtie de filtru din fibră de sticlă (4.2). Se reţine această soluţie pentru faza de purificare (5.3).
  2. 5.2.2. Premixuri (O,1-2,0 %)
    
    Se cântăreşte, cu o precizie de 0,001 g, aproximativ 1 g din proba nemăcinată şi se transferă într-un pahar conic de 200 ml. Se adaugă 15,0 ml de apă, se amestecă şi se echilibrează timp de 5 minute. Se adaugă 35,0 ml de metanol-acetonitril (3.5), se astupă şi se agită timp de 30 de minute cu un agitator mecanic sau cu un agitator magnetic (4.1).Se filtrează soluţia printr-o hârtie de filtru cu fibră de sticlă (4.2). Se pipetează o parte alicotă a filtratului într-un balon gradat de 50 ml. Se adaugă 15,0 ml de apă, se aduce la semn cu metanol acetonitril (3.5) şi se omogenizeaza. Concentraţia de carbadox a soluţiei finale trebuie să fie de aproximativ 1O µg/ml. O parte alicotă este filtrată printr-un filtru de 0,45 µm (4.6). Se continuă cu dozarea HPLC (5.4).
  3. 5.2.3. Preparate ( > 2 %)
    
    Se cântăresc, cu o precizie de 0,001 g, aproximativ 0,2 g din proba nemăcinată şi se transferă într-un pahar conic de 250 ml. Se adaugă 45,0 ml de apă, se amestecă şi se echilibrează timp de 5 minute. Se adaugă 105,0 ml de metanol-acetonitril (3.5), se astupă şi se omogenizează. Proba se supune ultrasunetelor (4.7) timp de 15 minute, urmate de agitare mecanică sau magnetică timp de 15 minute (4.1). Se filtrează soluţia printr-o hârtie de filtru din fibră de sticlă (4.2). Se diluează o parte alicotă a filtratului cu amestecul de apă metanol-acetonitril (3.12) până la o concentraţie finală în carbadox de 10-15 µg/ml (pentru o preparare la 1O %, factorul de diluţie este de 1O). O parte alicotă este filtrată printr-un filtru de 0,45 µm (4.6). Se continuă cu determinarea HPLC (5.4).
3. 5.3. Purificare
  1. 5.3.1. Prepararea coloanei de oxid de aluminiu.
    
    Se cântăresc 4 g de oxid de aluminiu (3.4) şi se transferă în coloana de sticlă (4.3).
  2. 5.3.2. Purificarea probei
    
    Se aplică 15 ml din extractul filtrat (5.2.1) în coloana de oxid de aluminiu şi se elimină primii 2 ml de eluant. Se colectează următorii 5 ml şi se filtrează o parte alicotă printr-un filtru de 0,45 µm (4.6). Se continuă cu determinarea HPLC (5.4).
4. 5.4. Determinarea HPLC.
  1. 5.4.1. Parametri
    
    Următoarele condiţii sunt oferite pentru orientare; pot fi utilizate alte conditii numai dacă acestea dau rezultate
    
    echivalente '
    
    Coloană cromatografică lichidă (4.1.1):
    
    Fază mobilă (3.1O):
    
    Debit:
    
    300 mm x 4 mm, C18, umplere de
    
    1O µm sau echivalentă
    
    Amestec de soluţie tampon de acetat (3.9) şi acetonitril (3.2), 825+175(v+v).
    
    1,5-2 ml/min
    
    Lungimea undei detectie:
    
    '
    
    de 365 nm
    
    Volum de injecţie: 20 µI
    
    Se verifică stabilitatea sistemului cromatografic, injectând de mai multe ori soluţia de etalonare (3.11.2) conţinând 5,0 µg/ml, până când sunt obţinute înălţimi (arii) ale picurilor şi timpi
    
    de retentie constanti.
    
    ' '
  2. 5.4.2. Curbă de etalonare
    
    Se injectează fiecare soluţie de etalonare (3.11.2) de mai multe ori şi se măsoară înălţimile (ariile) picurilor pentru fiecare concentraţie. Se stabileşte o curbă de etalonare utilizând înălţimile sau ariile medii ale picurilor soluţiilor de etalonare ca ordonate şi concentraţiile corespondente în µg/ml ca abcise.
  3. 5.4.3. Soluţia probei
    
    Se injectează de mai multe ori extractul probei [(5.3.2) pentru furaje, (5.2.2) pentru premixuri şi (5.2.3) pentru preparate] şi se determină înălţimea (aria) medie a picurilor carbadoxului.
6. Calculul rezultatelor

Plecând de la înălţimea (aria) medie a picurilor carbadoxului soluţiei din probă, se determină concentraţia soluţiei din probă în µg/ml prin referire la curba de etalonare (5.4.2).
1. 6.1. Furaje:
  
  Conţinutul w în carbadox (mg/kg) din probă este dat de următoarea formulă
  
  w= v;[mg/ kg]
  
  m
  
  în care:
  
  o= concentraţia de carbadox a extractului din probă (5.3.2) în µg/ml.
  
  V1= volumul de extracţie în ml (adică 50 ml). m= masa porţiunii de test în g.
2. 6.2. Premixuri şi preparate
  
  Conţinutul w al probei în carbadox (mg/kg) este dat de următoarea formulă
  
  w=oxV2xf [mglkg ]
  
  m
  
  în care
  
  o= concentraţia de carbadox a extractului din probă (5.2.2 sau 5.2.3) în µg/ml.
  
  V2= volumul de extracţie în ml (adică 50 ml pentru premixuri; 150 pentru preparate).
  
  f = factor de diluţie conform 5.2.2 (premixuri) sau 5.2.3 (preparate).
  
  m= masa porţiunii de test în g.
7. Validarea rezultatelor
1. 7.1. Identitate
  
  Identitatea substanţei de analizat poate fi confirmată prin co-cromatografie sau utilizând un detector cu grup de diode prin care sunt comparate spectrele extractului din probă şi ale soluţiei de etalonare (3.11.2) conţinând 10,0 µg/ml.
  1. 7.1.1. Co-cromatografie
    
    Un extract al probei este îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi corespunzătoare de soluţie de etalonare (3.11.2). Cantitatea de carbadox adăugat trebuie să fie similară cantităţii estimate de carbadox constatată în extractul din probă.
    
    Numai înălţimea picului carbadoxului ar trebui să fie mărită după luarea în considerare atât a cantităţii adăugate cât şi a diluţiei extractului. Lărgimea picului, la jumătatea înălţimii sale maxime, trebuie să se situeze la ± 1O 0/o din lărgimea iniţială.
  2. 7.1.2. Detectare cu grup de diode
    
    Rezultatele sunt evaluate conform următoarelor criterii:
    1. a) lungimea de undă de absorbţie maximă a spectrelor probei şi a etalonului, înregistrată la vârful picului pe cromatogramă, trebuie să fie aceeaşi într-o marjă determinată de puterea de rezoluţie a sistemului de detecţie. Pentru detecţia prin grup de diode, aceasta este de obicei de +2 nm;
    2. b) între 225 şi 400 nm, spectrele probei şi ale etalonului, înregistrate la vârful picului pe cromatogramă, nu trebuie să fie diferite pentru aceste părţi ale spectrului într-un interval de 10-
      
      100 % al absorbanţei relative. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt prezente aceleaşi maxime şi când la nici un
      
      punct observat deviaţia între cele două spectre nu depăşeşte 15 % din absorbanta substantei de analizat etalon;
      
      ' '
    3. c) între 225 şi 400 nm, spectrele porţiunii ascendente, ale
    vârfului şi ale porţiunii descendente a picului, produse de extractul din probă, nu trebuie să fie diferite unele de altele pentru acele părţi ale spectrului într-un interval de 1O – 100 % al absorbanţei relative. Acf3st criteriu este îndeplinit atunci când
    
    sunt prezente aceleaşi maxime şi când la toate punctele observate, deviaţia dintre spectre nu depăşeşte 15 % din absorbanţa spectrului vârfului.
    
    Dacă unul din aceste criterii nu este îndeplinit, prezenţa substantei de analizat nu a fost confirmată.
    
    '
2. 7.2. Repetabilitate
  
  Pentru un conţinut de 1O mg/kg şi mai mare, diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe aceeaşi probă nu trebuie să depăşească 15 % din rezultatul superior.
3. 7.3. Recuperare
  
  Pentru o probă (martor) îmbogăţită, recuperarea trebuie să fie de cel puţin 90%.
8. Rezultate ale unui test de colaborare

A fost organizat un studiu de colaborare în care şase furaje, patru premixuri şi trei preparate au fost analizate de opt laboratoare. Au fost efectuate analize în dublu pentru fiecare probă. (Mai multe informaţii detaliate cu privire la acest studiu de colaborare pot fi găsite în Jurnalul AOAC, Volumul 71, 1988, pag. 484-490.) Rezultatele studiului (cu excepţia valorilor aberante) sunt indicate mai jos:

AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR

O R D I N

pentru aprobarea Normei veterinare privind metodele de analiză

pentru controlul oficial al furajelor cu referire la determinarea umidității, a grăsimilor

și uleiurilor vegetale, a magneziului și conținutului în fibre*)

Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia,

văzând Referatul de aprobare nr. 153.597 din 25 mai 2004 al Direcției generale veterinare,

președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin:

Art. 1. — Se aprobă Norma veterinară privind metodele de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu referire la determinarea umidității, a grăsimilor și uleiurilor vegetale, a magneziului și conținutului în fibre, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art. 2. — Institutele centrale de profil, direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a

municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Art. 3. — Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prevederilor prezentului ordin.

Art. 4. — Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor,

Liviu Harbuz

București, 10 iunie 2004.

Nr. 26.

*) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 26/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis.

**) Anexa este reprodusă în facsimil.

NORMĂ VETERINARĂ

privind metodele de analiză pentru controlul oficial al furajelor

cu referire la determinarea umidității, a grăsimilor și uleiurilor vegetale, a magneziului și conținutului în fibre

ANEXĂ

la norma veterinară

105°C. Se continuă să se amestece, amestecând până la fund fiola, până când bulele nu se mai formează.

Pentru a se asigura eliminarea completă a umidităţii, se reîncălzeşte de mai multe ori la 103 QC +2 QC, se răceşte la 93°C între încălziri succesive. Apoi se lasă să se răcească la temperatura camerei, în exsicator (3.4) şi se cântăreşte. Se repetă această operaţiune până când pierderea în masă între două cântăriri succesive nu mai depăşeşte 2 mg.

N.B. O creştere a masei probei după încălzire repetată indică o oxidare a grăsimilor, în care caz se calculează rezultatul de la cântărirea efectuată imediat înainte ca masa să înceapă să crească.

5. Calcularea rezultatelor

Conţinutul de umiditate, ca procentaj din probă, este dat de următoarea formulă:

(M1 – M2) • 100/Mo

unde:

Mo = masa probei test, în grame;

M1 = masa fiolei cu conţinutul acesteia înainte de încălzire, în grame,

M2= masa fiolei cu conţinutul acesteia după încălzire, în grame, Rezultate mai mici de 0,05% trebuie să fie înregistrate ca

,,mai mici de O,705″.

Fidelitate

Diferenta de umiditate între rezultatele a două determinări paralele efe' ctuate privind aceeaşi probă nu trebuie să

depăşească O,705% în valoare absolută.
1. 2. DETERMINAREA MAGNEZIULUI
  
  – PRIN SPECTROMETRIE CU ABSORBTIE ATOMICĂ –
  1. 1. Domeniu şi scop '
    
    Această metodă face posibil să se determine cantitatea de magneziu din furaje. Aceasta se consideră corespunzătoare, în special, pentru determinarea conţinutului de magneziu mai scăzut de 5%.
  2. 2. Principiu
    
    Proba este calcinată şi dizolvată în acid clorhidric diluat. Dacă proba calcinată conţine substanţe anorganice, aceasta este dizolvată direct în acid clorhidric diluat. Solutia este diluată
    
    şi conţinutul de magneziu determinat prin spe' ctrometrie cu
    
    absorbţie atomică, la lungimea de undă de 285 72 nm, prin compararea cu soluţii standard.
  3. 3. Reagenţi
    1. 3.1. Acid clorhidric a.p.d: 1 716.
    2. 3.2. Acid clorhidric concentrat a.p.d : 1719.
    3. 3.3. Bandă sau sârmă de magneziu, sau heptahidrat sulfat de magneziu, uscat la temperatura camerei.
    4. 3.4. Soluţie salină de stronţiu (clorura sau nitrat) la 2,75% (w/v) stronţiu (= 76,708 g SrCl2 6H20 a.p., sau 60,738 g Sr(NO3)2 a.p.).
    5. 3.5. Soluţie de magneziu standard cântărită cu aproximaţie de 1 mg, 1 g de magneziu (3.3) de la care s-a îndepărtat anterior cu grijă învelişul de oxid format sau cantitatea corespondentă (1O, 7143 g) de heptahidrat sulfat de magneziu (3.3). Se pune într-o sticlă plată gradată de 1OOO ml, se adaugă
      
      80 ml acid clorhidric (3.1), se lasă să se dizolve şi se
      
      completează până la 1OOO ml cu apă. 1 ml din această soluţie conţine 1000 mg magneziu.
  4. 4. Aparat
    1. 4.1. Creuzete de calcinare din platină, siliciu sau porţelan
    2. 4.2. Cuptor cu muflă electrică cu termostat.
    3. 4.3. Spectrometru cu absorbţie atomică.
  5. 5. Procedură
    1. 5.1. Prepararea soluţiei probă
      1. 5.1.1. Furaje compuse exclusiv din substanţe minerale
        
        Se cântăresc cu aproximaţie de 1 mg, 5 g din probă, într-o sticlă plată de 500 ml cu 250 până la 300 ml apă. Se adaugă 40 ml acid clorhidric (3.1), se aduce la punctul de fierbere şi se menţine lichidul cu grijă la fierbere timp de 30 de minute. Se lasă să se răcească, reformând volumul cu apă, se amestecă şi se filtrează într-o cupă uscată printr-un filtru plisat uscat. Se înlătură primii 30 ml filtraţi. În prezenţa siliciului, se tratează 5 g de probă cu o cantitate suficientă (15-30 ml) de acid clorhidric (3.2), se evaporă până la uscare într-o baie de apă şi se transferă într-un cuptor la 105°C pentru o oră. Se procedează ca la a treia propoziţie de la 5.1.2.
      2. 5.1.2. Furaje compuse predominant din substanţe minerale.
        
        Se cântăresc cu aproximaţie de 1 mg, 5g de probă, într-un creuzet şi se calcinează la 550 QC într-un cuptor cu muflă, până este obt'inută o substant'ă de calcinare ce este liberă de
        
        particule carbonice şi se l•asă să se răcească. Pentru a se
        
        elimina siliciu, se adaugă substanţa de calcinare într-o cantitate suficientă (15-30 ml) de acid clorhidric (3.2), se evaporă până la uscare într-o baie de apă şi se transferă într-un cuptor, la 105°C, timp de o oră. Se tratează reziduul cu 1O ml acid clorhidric (3.1) şi se transferă într-o sticlă plată gradată de 500 ml, utilizând apă caldă. Se lasă să se răcească şi se reformează volumul cu apă. Se amestecă şi se filtrează într-o cupă uscată, printr-un filtru plisat uscat. Se înlătură primii 30 ml filtrati.
        
        '
      3. 5.1.3. Furaje ce conţin predominant substanţe organice
        
        Se cântăresc cu aproximaţie de 1 mg, 5g de probă într-un creuzet şi se calcinează la 550 QC într-un cuptor cu muflă, până
        
        este obtinută o substantă de calcinare ce este liberă de particule' carbonice. Se tra'tează substanţa de calcinare cu 5 ml
        
        acid clorhidric (3.2), se evaporă până la uscare într-o baie de apă şi apoi se usucă pentru o oră într-un cuptor, la 105 QC, pentru a se reda siliciu insolubil. Se tratează substanţa de calcinare cu 5 ml acid clorhidric (3.1) şi se transferă într-o sticlă
        
        plată gradată de 250 ml utilizând apă caldă; se aduce la punctul de fierbere, se lasă să se răcească şi se formează volumul cu apă. Se amestecă şi se filtrează într-o cupă uscată printr-un filtru plisat uscat. Se înlătură primii 30 ml filtraţi.
    2. 5.2. Măsurare prin absorbţie atomică
      
      Prin dizolvarea soluţiei standard (3.5) cu apă, se prepară cel puţin cinci soluţii de referinţă de concentraţie cunoscuta, ce corespund şirului de măsurare optim al spectrofotometrului. Se adaugă fiecărei soluţii 1O ml soluţie salină de stronţiu (3.4) şi apoi se reformează volumul la 100 ml, cu apă. Se dizolvă în apă o picătură din partea filtrată obţinută de la 5.1.1, 5.1.2 sau 5.1.3, astfel încât să se obţină o concentraţie de magneziu ce este în cadrul limitelor de concentratie a solutiilor de referintă.
      
      Concentratia acidului clorhidric din ace'astă solu'tie nu trebuie s' ă
      
      depăşeasc'ă O 74 N. Se adaugă 1O ml soluţie sa' lină de stronţiu
      
      (3.4) şi apoi se reformează volumul la 100 ml cu apă. Se măsoară absorbţia din soluţia determinată şi din soluţiile de referinţă la lungimea de undă de 285.2 nm.
  6. 6. Calcularea rezultatelor
  Se calculează cantităţii de magneziu din probă, prin relaţie cu soluţiile de referinţă. Rezultatul se exprimă ca procentaj din probă.
  
  Repetabilitate
  
  Diferenţa dintre rezultatele celor două determinări paralele efectuate pe aceeaşi probă nu trebuie să depăşească 5 %, din valoarea relativă.
2. 3. DETERMINAREA CELULOZEI (FIBRĂ BRUTĂ)

1. Domeniu şi scop

Această metodă face posibil să se determine substanţele libere de materii organice grase din furaje ce sunt insolubile în acid şi medii alcaline şi sunt descrise convenţional ca fibre brute (celuloză).
2. Principiu

Proba, degresată dacă este necesar, este tratată în mod succesiv cu soluţii fierbinţi de acid sulfuric şi hidroxid de potasiu de concentraţii specificate. Reziduul este separat prin filtrare printr-un filtru din sticlă sinterizată, spălat, uscat, cântărit şi calcinat între valori de 474 la 500 QC . Pierderea de greutate ce rezultă din calcinare corespunde celulozei (fibrei brute) prezente în proba test.
3. Reagenţi
1. 3.1 Acid sulfuric, c = O,13 mol/I
4. Aparat
5. Procedură

Se cântăreşte, cu aproximaţie de 0,001 g, 1g de probă preparată, se pune în creuzet (4.2), (vezi observaţiile de la 8.1, 8.2 şi 8.3) şi se adaugă 1g de material auxiliar de filtrare(3.3).

Se asamblează unitatea de încălzire (4.1) şi creuzetul de filtrare (4.2), apoi se ataşează cilindru (4.3) la creuzet. Se picură (adaugă) 150 ml de acid sulfuric fiert (3.1) în cilindrul şi creuzetul asamblat iar dacă este necesar se adaugă câteva picături de agent anti-spumă (3.2)

Se aduce lichidul la punctul de fierbere în 5 ± 2 minute şi se fierbe energic pentru exact 30 minute.

Se deschide robinetul tubului de eliminare (4.1) şi, în condiţii de vacuum, se filtrează acidul sulfuric printr-un creuzet de filtrare şi se spală reziduul de trei ori consecutiv, cu 30 ml părţi de apă fiartă, asigurându-se că reziduul este filtrat uscat după fiecare spălare,

Se închide robinetul de evacuare şi se picură (adaugă)

150 ml soluţie de hidroxid de potasiu (3.7) în cilindrul şi creuzetul asamblat şi se adaugă câteva picături de agent anti spumă (3.2). Se aduce lichidul la punctul de fierbere în 5 ±2 minute şi se fierbe energic pentru exact 30 minute. Se filtrează şi se repetă procedura de spălare utilizată pentru acidul sulfuric.

După spălarea şi uscarea finală, se deconectează creuzetul şi conţinutul acestuia şi se reconectează la unitatea de extracţie la rece (4.6). Se aplică vacuum şi se spală reziduul din creuzet consecutiv cu trei porţiuni de 25 ml de acetonă (3.4) asigurându-se că reziduul este filtrat uscat după fiecare spălare.

Se usucă creuzetul până la greutate constantă, în cuptor, la 130 °e. După fiecare uscare se răceşte în exicator şi se

cântăreşte repede. Se pune creuzetul într-un cuptor cu muflă şi se calcinează până la greutate constantă la temperatură de la

475 °e până la 500 °e pentru cel puţin 30 minute.

După fiecare încălzire înainte de cântărire se răceşte mai întâi în cuptor şi apoi în exicator.

Se efectuează un test blanc fără probă. Pierderea de greutate ce rezultă din calcinare nu trebuie să depăşească 4 mg.
6. Calcularea rezultatelor

Conţinutul de celuloză (fibră crudă) ca procentaj din probă este dat de expresia:

(b- c)xlOO

a

unde:

a = masa probei în g

b = pierderea de masă după calcinare în timpul determinării, în g;

c = pierderea de masă după calcinare în timpul testului orb, în g.
7. Repetabilitate

Diferenţa între două determinări paralele, efectuate pe aceeaşi probă, nu trebuie să depăşească
- – 0,3 în valoare absolută pentru conţinutul de celuloză (fibră crudă) mai mic de 1O %
- – 3 % cu referire la rezultatul cel mai mare, pentru conţinutul de celuloză (fibră crudă) egal sau mai mare de 1O 0/o.
8. Observatii

8.1. Furajele ce conţin mai mult de 1O % grăsimi

elementare trebuie să fie degresate înainte de analiză, cu eter de petrol (3.5). Se conectează creuzetul de filtrare (4.2) şi conţinutul acestuia la unitatea de extracţie la rece (4.6) ,se aplică vacuum şi se spală consecutiv reziduul cu trei părţi de 30 ml de eter de petrol, asigurându-se că reziduul este uscat. Se conectează creuzetul şi conţinutul acestuia la unitatea de încălzire (4.1) şi se continuă aşa cum se descrie la punctul 5.

	Redacția Lex24 Drept la Sursa!
	Articole Urmărește

	Redacția Lex24
	Publicat in Repertoriu legislativ, 19/11/2024

(b)	SH =	7Sa +4S4 +S2 -2S1
		10

Informatii Document

(4.4) un dop de vată de bumbac sau de sticlă (3.9), se umple două treimi din tub cu cloroform (3.2) şi se adaugă 5 g de sulfat de sodiu (3.1O).

4. Procedură

5. Calcularea rezultatelor

6. Observatie

li. DETERMINAREA BAZELOR AZOTATE VOLATILE

A. MICRODIFUZIE

1. Scop şi domeniu de aplicare

2. Principiu

3. Reactivi

4. Aparatură

5. Procedură

6. Calcularea rezultatelor

7. Observatie

B. PRIN DISTILARE

1. Scopul şi domeniul de aplicare

2. Principiu

4. Aparatură

5. Procedură

6. Calcularea rezultatelor–

1. Scop şi domeniu de aplicare

2. Principiu

3. Reactivi

4. Aparatură

5. Procedură

6. Calcularea rezultatelor

IV. DETERMINARE DE ULEIURI ŞI GRĂSIMI BRUTE

2. Principiu

3. Reactivi

4. Aparatură

5. Procedură

7. Procedura de testare

(d) log A= (u1 +u2+u4-s1-s2-sJx0,401

(d'} log A= (u2+u4+u8-s1-s4-s8)x0,401

2. Determinarea de flavofosfolipol prin difuziune in mediu de agar

3.1. Mentinerea culturii stoc

4.1 Mediu de cultură (poate fi utilizat orice mediu de cultură comercial, de compoziţie similară şi care dă aceleaşi rezultate, de ex. mediu antibiotic oxoid 1 (cm 327) cu un adaos de agar oxoid n 3 (L 13)).

3. Determinarea oligoelementelor: fier, cupru, mangan şi zinc

Pregătirea probei pentru analiză

Reactivi şi aparatură

E primarea rezultatelor

2. Determinarea acidului cianhidric

3. Determinarea calciului

4. Determinarea carbonatilor

5. Determinarea cenuşii brute

6. Determinarea cenuşii, insolubilă in acid clorhidric

7. Determinarea clorului din cloruri

8. Determinarea uleiului de muştar

9. DETERMINAREA LACTOZEI

1O. Determinarea potasiului

11. Determinarea sodiului

12. Determinarea zahărului

Tabel de valori pentru 25ml de reactiv Luff-Schoorl

14. Determinarea ureei

1,4 X (a-b)

2. Determinarea monenzinului de sodiu prin difuzie in mediu de agar

3. Reactivi

4. Aparatură

5. Metodă de lucru

6. Calcularea rezultatelor

7. Evaluarea metodei

8. Utilizarea materialelor de referintă

9. Observatii

PARTEA B

DETERMINAREA ULEIURILOR ŞI GRĂSIMILOR BRUTE

PARTEAC DETERMINAREA OLAQUINDOXULUI

1. Scop şi aplicabilitate

2. Principiu

3. Reactivi

4. Aparatură

5. Metodă de lucru

6. Calcularea rezultatelor

7. Validarea rezultatelor

2. DETERMINAREA METIL BENZOATULUI

5. Procedură

6. Calcularea rezultatelor

7. Validarea rezultatelor

8. Rezultatele unui studiu de colaborare

A fost organizat un studiu de colaborare în care 2 probe de premixuri (probele 1 şi 2) şi 5 probe de furaje (probele 3-7) au fost analizate de 12 laboratoare. Pentru fiecare probă au fost efectuate analize duble. Rezultatele sunt date în următorul tabel:

PARTEA B DETERMINAREA DICLAZURILULUI