NORMA SANITARĂ VETERINARA din 4 decembrie 2002

privind procedurile de diagnostic, metodele de prelevare a probelor şi criteriile pentru evaluarea rezultatelor testelor de laborator, pentru confirmarea pestei porcine clasice



 + 
Articolul 1(1) Autoritatea veterinara centrala a României trebuie să se asigure ca pesta porcina clasica este confirmată, conform procedurilor de diagnostic, metodelor de prelevare a probelor şi criteriilor pentru evaluarea rezultatelor testelor de laborator stabilite în Manualul de diagnostic al pestei porcine clasice, prevăzut în anexa la prezenta norma sanitară veterinara, pe baza: … a) detectarii semnelor clinice de boala şi a leziunilor post-mortem; … b) detectarii virusului, antigenului sau genomului sau în probe de tesuturi, organe, sânge sau secretii; … c) demonstrării răspunsului cu anticorpi specifici în probele de sânge. … (2) Laboratoarele naţionale de diagnostic la care se face referire la lit. A din anexa nr. 3 la Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice pot face modificări ale testelor de laborator la care se face referire în Manualul de diagnostic al pestei porcine clasice, prevăzut în anexa la prezenta norma sanitară veterinara, sau pot folosi alte teste, cu condiţia să fie demonstrata o sensibilitate şi o specificitate egala cu cele menţionate de norme. Sensibilitatea şi specificitatea acestor teste modificate sau diferite trebuie să fie evaluate în cadrul testelor comparative organizate periodic de Laboratorul Comunitar de Referinţa pentru Pesta Porcina Clasica. …  + 
Articolul 2(1) Autoritatea veterinara centrala a României poate adopta acte normative sau prevederi administrative suplimentare necesare pentru a asigura aplicarea şi respectarea prevederilor prezentei norme sanitare veterinare. … (2) Autoritatea veterinara centrala a României va lua măsurile necesare şi va sanctiona, potrivit legii, orice încălcare a prevederilor prezentei norme sanitare veterinare. … (3) Atunci când autoritatea veterinara centrala a României adopta cele menţionate în prezenta norma sanitară veterinara, trebuie să facă o referire expresă la prezenta norma sanitară veterinara. …  + 
Anexa 1––-la norma sanitară veterinara–––––––––-MANUALde diagnostic al pestei porcine clasice + 
Capitolul 1Introducere, obiective şi definiţii1. Pentru a se asigura proceduri uniforme privind diagnosticul pestei porcine clasice, prezentul manual cuprinde:a) îndrumări şi cerinţe minime pentru proceduri de diagnostic, metode de prelevare a probelor şi criterii pentru evaluarea rezultatelor examinarilor post-mortem şi a testelor de laborator, pentru diagnosticul corespunzător al pestei porcine clasice*1); … b) cerinţe minime de biosecuritate şi standarde de calitate, care trebuie respectate de laboratoarele de diagnostic pentru pesta porcina clasica şi în cazul transportului probelor; … c) testele de laborator care urmează să fie folosite pentru diagnosticul pestei porcine clasice şi tehnicile de laborator folosite pentru tipizarea genetica a culturilor de virus al pestei porcine clasice. … 2. Informaţiile cuprinse în prezentul manual sunt destinate în special autorităţilor responsabile cu controlul pestei porcine clasice, accentul fiind pus pe aplicatiile testelor şi pe evaluarea rezultatelor acestora, şi nu pe tehnici de laborator detaliate.3. În sensul prezentului manual, în plus faţă de definiţiile prevăzute în art. 2 din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice, se înţelege prin:a) exploatatie suspecta – orice exploatatie de porci care conţine unul sau mai mulţi porci suspecti de a fi infectati cu virusul pestei porcine clasice sau o exploatatie de contact, astfel cum este definită în art. 2 lit. v) din norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice; … b) reactant unic – orice porc care prezintă un rezultat pozitiv la teste serologice pentru pesta porcina clasica, dar care nu a avut nici un contact cu virusul pestei porcine clasice şi de la care nu exista nici un indiciu de răspândire a bolii la porcii de contact*2). … c) subunitate epidemiologica sau subunitate – clădirea, spaţiul sau terenul apropiat, în care sunt ţinute grupuri de porci dintr-o exploatatie, astfel încât aceştia au contact direct sau indirect unul cu celălalt, dar sunt separati de ceilalţi porci ţinuţi în aceeaşi exploatatie; … d) porci în contact – porcii care trăiesc într-o exploatatie în contact direct cu unul sau mai mulţi porci suspecti de a fi infectati cu virusul pestei porcine clasice în ultimele 21 de zile. … ––––*1) Când se stabileşte numărul de probe ce trebuie prelevate pentru testarea de laborator, senzitivitatea testelor ce vor fi folosite trebuie, de asemenea, să fie luată în considerare. Numărul de animale ce urmează să fie prelevate va fi mai mare decât cel indicat în manual, dacă senzitivitatea testului ce urmează să fie folosit nu este prea mare.*2) Reactantii unici pot avea titrul anticorpilor neutralizati în jur de limita (ceea ce adesea nu este cazul) până la foarte pozitiv. La retestare reactantii unici pot prezenta un titru constant sau în scădere. În general, doar putini porci dintr-un lot pot prezenta aceste rezultate. + 
Capitolul 2Descrierea pestei porcine clasice cu accente pe diagnosticul diferentialA. Introducere1. Pesta porcina clasica este cauzată de un virus ARN incapsulat, care aparţine genului Pestivirus din familia Flaviviridae. Acest virus este inrudit cu un pestivirus intalnit la rumegatoare care cauzează diareea virala bovina (BVDV) şi boala de granita (BDV). Aceasta relaţie a avut consecinţe serioase de diagnostic ca reactii incrucisate apărute ce pot da raspunsuri fals pozitive la testele de laborator.2. Virusul pestei porcine clasice este relativ stabil în excretiile umede ale porcilor infectati, în carcasele de porci, în carnea proaspăta de porc şi în unele produse din carne de porc. Acest virus este rapid inactivat de detergenti, solventi lipidici, proteaze şi substanţe dezinfectante comune.3. Principala cale naturala de infectie este cea oronazala, prin contact direct sau indirect cu porcii infectati sau prin consumul de hrana contaminata cu virus în zone cu densitate mare de porci, răspândirea virusului realizandu-se cu usurinta între exploatatiile de porci vecine. De asemenea, transmiterea bolii se poate realiza şi prin materialul seminal al vierilor infectati.4. Perioada de incubaţie pentru animale, individual, este de la o săptămâna până la 10 zile, dar în condiţii de teren simptomele clinice pot deveni evidente într-o exploatatie doar după doua până la 4 săptămâni de la introducerea virusului sau chiar mai mult, dacă sunt implicaţi numai porcii adulti sau tulpini de patogenitate medie.5. Semnele clinice ale pestei porcine clasice sunt extrem de variabile şi aceasta poate fi confundata cu multe alte boli. Severitatea simptomelor depinde în principal de vârsta animalului şi de virulenta virusului. În general, animalele ţinere sunt afectate mai grav decât cele adulte. La porcii adulti evoluţia infectiei este adesea moderata sau subclinica.6. Pot fi identificate formele acute, cronice şi prenatale de pesta porcina clasica.B. Forma acuta1. Porcii intarcati şi cei pentru ingrasat prezintă cel mai adesea forma acuta de pesta porcina clasica. Semnele iniţiale sunt anorexia, letargia, febra, conjunctivita, inflamarea limfonodulilor, semne respiratorii şi constipatie urmată de diaree. Hemoragii tipice ale pielii sunt, în general, observate pe urechi, coada, abdomen şi pe partea interna a coapselor din timpul celei de-a doua şi a treia săptămâni de la infectie şi până la moarte. Semnele neurologice sunt frecvent observate, ca de exemplu: mersul titubant, incoordonarea miscarilor şi convulsii. Un semn constant este febra. Aceasta este în general mai mare de 40°C, dar la porcii adulti febra nu depăşeşte 39,5°C.2. Virusul pestei porcine clasice cauzează leucopenie şi imunosupresie, care adesea conduc la infectii respiratorii şi enterice secundare. Semnele acestor infectii secundare pot masca sau se pot suprapune semnelor celor mai caracteristice ale pestei porcine clasice şi pot induce în eroare fermierul sau medicul veterinar. Moartea apare de obicei în termen de o luna. Revenirea din boala, cu producere de anticorpi, apare cel mai adesea la animalele adulte de reproducţie care nu prezintă semne clinice severe. Anticorpii împotriva pestei porcine clasice sunt detectabili la 2-3 săptămâni de la producerea infectiei.3. La examinarea post-mortem modificările patologice vizibile sunt cel mai frecvent observate în limfonoduli şi rinichi. Limfonodulii devin inflamati, edematiati şi hemoragici. Hemoragiile în rinichi pot varia de la dimensiunea unei petesii greu vizibile până la hemoragii echimotice. Hemoragii similare pot fi, de asemenea, observate în vezica urinara, laringe, epiglota şi cord şi uneori răspândite pe seroasele abdominale şi toracale. Este adesea intalnita encefalita nonpurulenta. Pot fi observate leziuni datorate infectiilor secundare ce pot induce în eroare medicul veterinar. Infarctele splenice sunt considerate patognomonice, dar nu sunt intalnite frecvent.4. În general forma acuta a pestei porcine africane indica o imagine clinica şi patologica similară cu cea a pestei porcine clasice. Atunci când sunt prezente hemoragii ale pielii şi ale urechilor, acestea sunt uşor de detectat şi conduc la suspiciunea de pesta porcina africana sau pesta porcina clasica. Alte câteva boli cauzează leziuni similare. Pesta porcina clasica acuta trebuie să fie, de asemenea, luată în considerare în cazul când este suspectat rujetul, sindromul reproductiv respirator al porcilor, intoxicatii cumarinice, purpura hemoragica, sindromul de slabire multisistemic după intarcare, dermatita porcina şi sindromul nefrotic, infectii cu Salmonella ori Pasteurella sau orice sindroame enterice ori respiratorii cu febra, care nu răspund la tratament cu un antibiotic.5. Virusul pestei porcine clasice este eliminat prin saliva, urina şi fecale de la apariţia semnelor clinice până la moartea animalului. Virusul pestei porcine clasice poate fi, de asemenea, eliminat prin sperma.C. Forma cronica1. Forma cronica a bolii apare atunci când porcii nu pot dezvolta un răspuns imun împotriva virusului pestei porcine clasice. Iniţial semnele unei infectii cronice sunt similare cu cele ale infectiei acute. Apoi sunt prezente semnele nespecifice, de exemplu: febra intermitenta, enterita cronica şi cahexia. Lipsesc hemoragiile tipice de la nivelul pielii. Aceşti porci pot prezenta semne clinice de boala cu 2-3 luni înainte de moarte. Virusul pestei porcine clasice este constant eliminat de la apariţia semnelor de boala până la moartea animalului. Anticorpii pot fi detectati temporar în probe de ser sanguin.2. Modificările patologice sunt mai puţin tipice, nu pot fi observate hemoragii în organe şi pe seroase. La animalele care prezintă diaree cronica leziunile necrotice sunt prezente pe ileon, pe valva ileocecala şi rectala.3. Semnele clinice ale formei cronice sunt aproape nespecifice şi multe alte boli trebuie să fie luate în considerare pentru realizarea diagnosticului diferential. Hipertermia poate să nu fie prezenta la fiecare animal, dar în exploatatiile infectate poate fi detectata cel puţin la cativa porci.D. Forma prenatala şi inaparenta de boala1. Virusul pestei porcine clasice poate trece prin placenta animalelor gestante şi infecteaza fetusii, dar la scroafe boala este adesea subclinica. Infectarea scroafelor peste perioada de 90 de zile de gestatie poate duce la fatarea de purcei cu viremie persistenta, care pot fi normali clinic la naştere şi pot sa supravietuiasca câteva luni. După naştere ei pot prezenta o creştere incetinita, slabire sau ocazional tremuraturi congenitale. Aceasta faza a infectiei se numeşte "izbucnirea tarzie a pestei porcine clasice" sau "forma inaparenta". Aceşti purcei pot juca un rol crucial în răspândirea bolii şi în menţinerea persistentei virusului în cadrul populaţiei, atât timp cat ei elimina constant virus până la moarte.2. Detectarea pestei porcine clasice poate fi dificila, în special în exploatatiile de reproducţie a porcilor, deoarece evoluţia infectiei poate fi foarte uşoară şi poate fi uşor confundata cu multe alte aspecte patologice. Reducerea fertilitatii şi avorturile pot fi cauzate atât de virusul pestei porcine clasice, cat şi de infectia cu parvovirus, sindromul respirator reproductiv al porcilor, leptospiroza şi boala lui Aujeszky. Materialul avortat, provocat de infectia cu virusul pestei porcine clasice, nu poate fi deosebit patologic de avorturile produse de agenţii altor boli. În cazul suspectarii unei boli infectioase a tractusului reproductiv, trebuie să fie efectuată imediat o ancheta pentru prezenta pestei porcine clasice atunci când exploatatia în cauza poate fi considerată ca risc (de exemplu, datorită localizarii exploatatiei într-o zona unde pesta porcina clasica apare la porci salbatici) şi, în orice caz, cu atât mai repede cu cat au fost eliminate mai multe boli infectioase comune ale tractusului respirator. + 
Capitolul 3Principalele criterii pentru considerarea unei exploataţii ca fiind suspecta de pesta porcina clasicaO exploatatie poate fi considerată suspecta pe baza următoarelor criterii:a) semnele clinice şi patologice la porci. Cele mai importante semne clinice ce trebuie luate în considerare sunt: … 1. febra cu morbiditate şi mortalitate crescută;2. febra cu sindrom hemoragic;3. febra cu simptome neurologice;4. febra cu origine necunoscută la care tratamentul cu antibiotice nu a îmbunătăţit starea de sănătate;5. avorturi şi creşterea problemelor de fertilitate în ultimele 3 luni;6. tremur congenital al purceilor;7. animale cu boli cronice;8. întârzierea creşterii la tineret;9. hemoragii petesiale şi echimotice, în special în limfonoduli, rinichi, splina, vezica şi laringe;10. infarcte sau hematoame, în special în splina;11. decelarea de butoni – ulceratii în intestinul gros, în special în apropierea jonctiunii ileocecale;b) semnele epidemiologice. Cele mai importante aspecte epidemiologice ce trebuie luate în considerare sunt: … 1. contactul direct sau indirect cu o exploatatie de porci dovedită a fi infectata cu virusul pestei porcine clasice;2. furnizarea porcilor care ulterior au prezentat semne de pesta porcina clasica dintr-o exploatatie;3. insamantarea scroafelor cu sperma provenită din surse suspecte;4. existenta unui contact direct sau indirect cu porci salbatici ai unei populaţii în care a apărut pesta porcina clasica;5. ţinerea în libertate a porcilor într-o regiune în care porcii salbatici sunt infectati cu virusul pestei porcine clasice;6. hranirea porcilor cu resturi culinare şi existenta suspiciunii ca acestea nu au fost tratate astfel încât să fie inactivat virusul pestei porcine clasice;7. posibilitatea apariţiei unei expuneri, de exemplu intrarea persoanelor, a transporturilor etc.;c) aspecte corelate cu rezultatele testelor serologice. Cele mai importante aspecte de laborator ce trebuie luate în considerare sunt: … 1. reactie serologica cauzată de o infectie neobservata cu virusul pestei porcine clasice sau de vaccinare*1);2. reactia incrucisata între anticorpii pestei porcine clasice şi alte pestivirusuri*2);3. detectarea porcilor reactanti unici*3).––––-*1) Dacă porcii au fost vaccinati contra pestei porcine clasice cu un vaccin convenţional, aceştia pot fi gasiti pozitivi datorită doar vaccinarii sau datorită reacţiei trecute a animalelor vaccinate.*2) În anumite circumstanţe până la 10% din porcii dintr-un lot pot avea anticorpi împotriva pestivirusurilor rumegatoarelor ce produc diareea virala bovina şi boala de granita (de exemplu, când porcii au contact direct cu bovine sau ovine infectate cu virusul BDV ori cu virusul BD sau atunci când porcii au intrat în contact cu materiale contaminate cu pestivirusuri de la rumegatoare).*3) În toate testele serologice curente pentru pesta porcina clasica, o mica proporţie din seruri da rezultate false sau pozitive, fie datorită lipsei de specificitate a titrului, fie datorită serurilor de la porci reactanti unici. + 
Capitolul 4Proceduri de verificare şi prelevare a probelorA. Reguli şi proceduri pentru examinarea clinica şi prelevarea probelor de la porcii din exploatatiile suspecte1. Autoritatea veterinara centrala a României se va asigura ca sunt efectuate examinari clinice adecvate, prelevări de probe şi investigaţii de laborator în exploatatiile suspecte pentru a confirma sau a exclude pesta porcina clasica, conform regulilor şi procedurilor stabilite la pct. 2-7.1.1 Indiferent de aplicarea, în exploatatia respectiva, a măsurilor prevăzute în art. 4 alin. (3) din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice, aceste reguli şi proceduri trebuie, de asemenea, să se aplice şi în cazurile de boala, ori de câte ori pesta porcina clasica este luată în considerare pentru diagnosticul diferential, chiar şi atunci când semnele clinice şi structura epidemiologica a bolii care este observata la porci sugereaza o probabilitate redusă a prezentei pestei porcine clasice.1.2 În toate celelalte cazuri în care unul sau mai mulţi porci sunt suspecti a fi infectati cu virusul pestei porcine clasice trebuie să se aplice, în exploatatiile suspecte în cauza, măsurile prevăzute în art. 4 alin. (3) din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice.1.3 În cazul suspicionarii pestei porcine clasice la porci într-un abator sau un mijloc de transport, trebuie să se aplice mutatis mutandis regulile şi procedurile stabilite la pct. 2-7.2. Atunci când un medic veterinar oficial viziteaza o exploatatie suspecta pentru a confirma sau a infirma prezenta pestei porcine clasice:a) trebuie să efectueze o verificare a producţiei şi a înregistrărilor de sănătate, dacă aceste înregistrări sunt disponibile; … b) trebuie să fie efectuată o inspecţie în fiecare subunitate, pentru a selecta porcii pentru examinarea clinica. Examinarea clinica trebuie să includă înregistrarea temperaturii corporale şi trebuie, în principal, să fie efectuată următoarelor categorii sau grupe de porci: … 1. porci bolnavi sau anorexici;2. porci recent refacuti după boala;3. porci recent introdusi din focare confirmate sau din alte surse suspecte;4. porci ţinuţi în subunitati recent vizitate de vizitatori externi care au avut recent un contact direct cu porci suspecti sau infectati cu virusul pestei porcine clasice sau pentru care au fost identificate alte contacte de risc cu o potenţiala sursa de virus al pestei porcine clasice;5. porci examinati deja şi testati serologic pentru pesta porcina clasica, în cazul în care rezultatele acestor teste au infirmat prezenta pestei porcine clasice, şi porci de contact. Dacă inspecţia în exploatatiile suspectate nu a indicat prezenta porcilor sau grupelor de porci la care s-a făcut referire anterior, autoritatea veterinara competenţa, fără a aduce atingere altor măsuri care trebuie aplicate în exploatatia în cauza conform Normei sanitare veterinare privind măsurile de control al pestei porcine clasice şi ţinând cont de situaţia epidemiologica, trebuie:6. sa continue efectuarea examinarilor în exploatatia în cauza, conform pct. 3 de mai jos; sau7. să se asigure ca sunt prelevate probe de sânge de la porcii din exploatatia în cauza pentru testări de laborator. În acest caz procedura de prelevare de probe menţionată la pct. 5 şi lit. F pct. 2 trebuie folosită în scopurile orientarii; sau8. să aplice sau sa menţină în exploatatia în cauza măsurile stabilite la art. 4 alin. (3) din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice, pe parcursul următoarelor investigaţii; sau9. sa infirme suspiciunea de pesta porcina clasica.3. Atunci când se face referire la prevederile prezentului punct, examinarea clinica în exploatatia în cauza trebuie să fie efectuată la porci selectaţi la întâmplare din subunitatile pentru care a fost identificat sau suspectat un risc de introducere al virusului pestei porcine clasice. Numărul minim de porci ce urmează să fie examinati trebuie să permită detectarea hipertermiei în aceste subunitati, dacă aceasta apare la o prevalenta de 10% cu 95% certitudine, iar în cazul:a) scroafelor de reproducţie, numărul minim de scroafe ce urmează să fie examinate trebuie să permită detectarea hipertermiei, dacă aceasta apare la o prevalenta de 5% cu 95% certitudine; … b) vierilor din centrele de colectare a spermei, trebuie să fie examinati toţi vierii. … 4. Dacă într-o exploatatie suspecta sunt detectati porci morţi sau muribunzi, examinarile post-mortem trebuie să fie efectuate la cel puţin 5 porci şi în special la porcii:a) care înainte de moarte au prezentat sau prezintă semne foarte evidente de boala; … b) cu hipertermie; … c) morţi recent. … 4.1. Dacă la aceste examinari nu s-au evidenţiat leziuni pe baza cărora să se suspicioneze pesta porcina clasica, ţinând cont de situaţia epidemiologica, sunt absolut necesare următoarele investigaţii ulterioare:a) o examinare clinica, conform pct. 3, şi recoltarea probelor de sânge, conform pct. 5, în subunitatile în care au fost porcii morţi sau muribunzi; şi … b) examinari post-mortem la 3-4 porci de contact. … 4.2. Independent de prezenta sau absenta leziunilor care indica pesta porcina clasica, trebuie să fie recoltate probe din organe sau tesuturi de la porcii care au fost examinati post-mortem, conform prevederilor cap. V lit. B pct. 1, pentru efectuarea testelor virusologice. Aceste probe trebuie să fie colectate, de preferinta, de la porcii morţi recent.4.3. Când este efectuată examinarea post-mortem, autoritatea veterinara competenţa trebuie să se asigure ca:a) sunt luate măsurile de precautie şi de igiena pentru a se preveni răspândirea bolii; şi … b) în cazul porcilor muribunzi, aceştia sunt ucisi respectându-se prevederile Normei sanitare veterinare privind protecţia animalelor în timpul tăierii sau uciderii acestora. … 5. Dacă sunt depistate semne clinice sau leziuni suplimentare care pot sugera prezenta pestei porcine clasice într-o exploatatie suspecta, dar autoritatea veterinara competenţa considera ca aceste aspecte nu sunt suficiente pentru a confirma un focar de pesta porcina clasica şi ca sunt necesare testări de laborator, trebuie recoltate probe de sânge de la porcii suspecti şi de la alţi porci din fiecare subunitate în care sunt ţinuţi porcii suspecti pentru testele de laborator, conform procedurii menţionate anterior. Numărul minim de probe ce trebuie prelevate pentru testări serologice trebuie să permită detectarea în subunitatea în cauza a seroprevalentei de 10% cu 95% certitudine, iar în cazul:a) scroafelor de reproducţie, numărul minim de scroafe de la care trebuie să se recolteze probe trebuie să permită detectarea unei prevalente de 5% cu 95% certitudine*1); … b) unui centru de colectare a spermei, trebuie recoltate probe de la toţi vierii. … Numărul probelor ce urmează a fi recoltate pentru testele virusologice va fi conform instrucţiunilor autorităţii veterinare competente, care va tine cont de varietatea testelor ce pot fi efectuate, de sensibilitatea testelor de laborator ce vor fi folosite şi de situaţia epidemiologica.6. Dacă suspicionarea pestei porcine clasice într-o exploatatie este legată de rezultatele testelor serologice anterioare, în plus faţă de probele de sânge ce urmează să fie recoltate de la porcii la care se face referire la pct. 2 lit. b) pct. 5, trebuie să se aplice următoarele proceduri:a) dacă porcii seropozitivi sunt scroafe gestante, unele dintre ele, de preferinta nu mai puţin de 3, vor fi eutanasiate şi supuse unei examinari post-mortem. Înainte de eutanasiere trebuie recoltate probe de sânge pentru testele serologice ulterioare. Fetusii trebuie supuşi examinării pentru detectarea virusului pestei porcine clasice, a antigenului sau a genomului acestui virus, conform cap. VI, pentru a detecta infectia intrauterina; … b) dacă porcii seropozitivi sunt scroafe cu purcei sugari, trebuie recoltate probe de sânge de la toţi purceii şi acestea trebuie să fie supuse examinării pentru virusul pestei porcine clasice, a antigenului sau a genomului viral, la care se face referire în cap. VI. Probele de sânge trebuie, de asemenea, să fie prelevate de la aceste scroafe pentru testele serologice ulterioare. … 7. Dacă după examinarea efectuată într-o exploatatie suspecta nu au fost detectate semne clinice sau leziuni caracteristice pestei porcine clasice, dar sunt solicitate de către autoritatea veterinara competenţa teste de laborator suplimentare pentru a infirma prezenta pestei porcine clasice, în scop de orientare trebuie să fie utilizate procedurile de prelevare de probe menţionate la lit. C pct. 5.––––*1) În unele cazuri, de exemplu când este suspectata pesta porcina clasica într-o exploatatie cu număr limitat de porci tineri, proporţia scroafelor infectate poate fi foarte mica. În aceste cazuri trebuie să se preleveze probe de la un număr mai mare de scroafe.B. Proceduri de prelevare a probelor într-o exploatatie în care sunt porci omorati în urma confirmării bolii1. Pentru a putea fi stabilite maniera introducerii virusului pestei porcine clasice într-o exploatatie infectata şi perioada de timp scursa de la introducerea acestuia, atunci când porcii sunt omorati în exploatatie ca urmare a confirmării unui focar de pesta porcina clasica, conform art. 5 alin. (1) din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice, trebuie să fie prelevate randomizat probe de sânge de la aceşti porci, când aceştia sunt ucisi în vederea efectuării testelor de laborator.2. Numărul minim de porci de la care urmează a fi prelevate probe de sânge trebuie să permită detectarea unei seroprevalente de 10% cu o certitudine de 95% la porcii din fiecare subunitate a exploatatiei. Probele pentru testele virusologice trebuie, de asemenea, recoltate în concordanta cu instrucţiunile autorităţii veterinare competente, care va tine cont de varietatea testelor ce pot fi utilizate, sensibilitatea testelor de laborator utilizate şi situaţia epidemiologica.3. În cazul focarelor secundare autoritatea veterinara competenţa poate decide să facă o derogare de la pct. 1 şi 2 şi sa stabilească procedurile de prelevare a probelor ad-hoc, ţinând cont de informaţiile epidemiologice disponibile deja de la sursa, şi mijloacele de introducere a virusului în exploatatie şi răspândire potenţiala a bolii în exploatatie.C. Proceduri de prelevare de probe atunci când într-o exploatatie suspecta porcii sunt omorati ca măsura preventivă*1)1. Pentru a confirma sau a infirma prezenta pestei porcine clasice şi pentru a obţine informaţiile epidemiologice necesare, atunci când porcii sunt omorati într-o exploatatie, ca măsura preventivă, conform prevederilor art. 4 alin. (3) lit. a) sau art. 7 alin. (2) din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice, probele de sânge pentru testele serologice, precum şi probele de sânge sau de amigdale pentru testele virusologice trebuie să fie recoltate conform procedurilor stabilite la pct. 2.2. Probele trebuie să fie recoltate, în primul rând, de la:a) porcii cu semne clinice sau leziuni post-mortem care sugereaza prezenta pestei porcine clasice, precum şi de la porcii de contact; … b) alţi porci care ar fi putut avea contacte de risc cu porci infectati sau suspecti ori cu porci suspecti de a fi contaminati cu virusul pestei porcine clasice. Prelevarea de probe de la aceşti porci trebuie să fie efectuată conform instrucţiunilor autorităţii veterinare competente, care va tine cont de situaţia epizootologica. În acest caz procedurile de prelevare a probelor stabilite la pct. 3, 4 şi 5 pot fi folosite pentru scopuri de orientare. … 3. În plus, porcii care provin din fiecare subunitate a exploatatiei pot fi utilizaţi pentru prelevarea probelor în mod randomizat*2). În acest caz numărul minim de probe ce vor fi prelevate pentru testele serologice trebuie să permită detectarea în unităţile în cauza a unei prevalente de 10% cu 95% certitudine.4. Totuşi, în cazul:a) scroafelor de reproducţie, numărul minim de scroafe utilizate pentru prelevare de probe trebuie să permită detectarea unor seroprevalente de 5% cu 95% certitudine*3); … b) unui centru de recoltare a materialului seminal, probele de sânge trebuie recoltate de la toţi vierii. … 5. Felul probelor ce trebuie prelevate pentru testele virusologice şi tipul testului folosit vor fi conforme cu instrucţiunile autorităţii veterinare competente, care va tine cont de tipul testelor care pot fi utilizate, de sensibilitatea testelor şi de situaţia epidemiologica.––––*1) Totuşi, dacă derogarea prevăzută de art. 6 alin. (1) din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice a fost aplicată, prelevarea de probe trebuie să intereseze subunitatile exploatatiei, atunci când porcii au fost omorati, fără a se prejudicia examinarile şi prelevarile de probe ulterioare ce urmează să se realizeze pentru porcii care au rămas în exploatatie, prelevări care vor fi efectuate în concordanta cu instrucţiunile autorităţii veterinare competente.*2) Totuşi, dacă autoritatea veterinara competenţa a limitat aplicarea medicinei preventive numai la o parte a exploatatiei unde sunt ţinuţi porci suspectati de a fi infectati sau contaminati cu virusul pestei porcine clasice, în concordanta cu art. 4 alin. (3) din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice, prelevarea de probe trebuie să se efectueze la subunitatile exploatatiei unde s-a aplicat măsura, fără a se prejudicia examinarile şi prelevarile de probe ulterioare ce vor fi efectuate la porcii rămaşi în exploatatie şi care se vor efectua în concordanta cu instrucţiunile autorităţii veterinare competente.*3) În unele cazuri, de exemplu când pesta porcina clasica este suspectata într-o exploatatie cu un număr limitat de porci tineri, proporţia de scroafe infectate poate fi foarte mica. În aceste cazuri trebuie prelevate probe de la un număr mai mare de scroafe.D. Verificarea şi procedurile de prelevare a probelor înainte de acordarea autorizaţiei de a muta porcii din exploatatiile situate în zone de protecţie sau de supraveghere şi în cazul în care aceşti porci sunt taiati sau omorati1. Fără a aduce atingere prevederilor art. 11 alin. (1) lit. f) pct. 2 din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice, pentru a se acordă autorizaţia de a muta porcii din exploataţii situate în zone de protecţie sau de supraveghere, conform art. 10 alin. (3) din aceeaşi norma sanitară veterinara, examinarea clinica ce va fi efectuată de medicul veterinar oficial trebuie:a) să fie efectuată într-o perioadă de 24 de ore înainte de mutarea porcilor; … b) să fie în concordanta cu prevederile stabilite la lit. A pct. 2. … 2. În cazul porcilor care vor fi mutati într-o alta exploatatie, în plus faţă de investigaţiile efectuate conform pct. 1, trebuie să fie efectuată o examinare clinica a porcilor în fiecare subunitate a exploatatiei în care sunt ţinuţi porcii ce urmează să fie mutati. În cazul porcilor mai mari de 3 până la 4 luni, examinarea trebuie să includă şi înregistrarea temperaturii corporale la o anumită proporţie de porci.2.1. Numărul minim de porci ce urmează să fie verificaţi trebuie să permită detectarea în aceste subunitati a febrei, dacă aceasta apare la prevalenta de 10% cu 95% certitudine.2.2. Totuşi, în cazul:a) scroafelor de reproducţie din subunitatile în care sunt ţinute scroafe ce urmează să fie mutate, numărul minim de scroafe ce urmează să fie examinate trebuie să permită detectarea febrei, dacă aceasta apare la o prevalenta mai mare de 5% cu 95% certitudine; … b) vierilor, trebuie examinati toţi vierii ce urmează să fie mutati. … 3. În cazul porcilor ce trebuie livraţi de la un abator la o fabrica de prelucrare sau în alte spaţii pentru a fi apoi omorati sau taiati, în plus faţă de investigaţiile ce vor fi efectuate conform pct. 1, trebuie să fie efectuată o examinare a porcilor în fiecare subunitate în care sunt ţinuţi porcii ce vor fi mutati. În cazul porcilor mai mari de 3 sau 4 luni, aceasta examinare trebuie să includă înregistrarea temperaturii corporale la o anumită proporţie din porcii existenţi.3.1. Numărul minim de porci ce urmează să fie verificaţi în subunitatile în cauza trebuie să permită detectarea febrei dacă aceasta apare la o prevalenta de 20% cu 95% certitudine.3.2. Totuşi, în cazul scroafelor de reproducţie, numărul minim de porci ce urmează a fi examinati trebuie să permită detectarea febrei, dacă aceasta apare în subunitatile în care sunt ţinuţi porcii ce urmează a fi mutati, la o prevalenta de 5% cu 95% certitudine.4. Atunci când porcii la care se face referire în pct. 3 sunt taiati sau omorati, probe de sânge pentru teste serologice ori probe de sânge sau de amigdale pentru testele virusologice trebuie să fie prelevate de la porci proveniţi din fiecare dintre subunitatile din care au fost mutati porcii.4.1. Numărul minim de probe ce urmează să fie prelevate trebuie să permită detectarea unei seroprevalente de 10% sau a unei prevalente a virusului cu o certitudine de 95% în fiecare subunitate.4.2. Totuşi, în cazul scroafelor de reproducţie sau al vierilor, în subunitatile în care aceşti porci au fost ţinuţi numărul minim de porci ce urmează să fie utilizaţi pentru prelevare de probe trebuie să permită detectarea unei seroprevalente de 5% sau a unei prevalente a virusului cu o certitudine de 95%.4.3. Felul probelor ce urmează să fie prelevate şi testul ce urmează să fie utilizat vor fi conforme instrucţiunilor autorităţii veterinare competente, care va tine cont de varietatea testelor care pot fi efectuate, sensibilitatea testelor şi de situaţia epidemiologica.5. Totuşi, dacă sunt depistate semne clinice sau leziuni post-mortem care indica pesta porcina clasica, atunci când porcii sunt taiati sau omorati, prin derogare de la pct. 4, trebuie să se aplice prevederile cu privire la prelevarea probelor prevăzute la lit. C.E. Verificarea şi procedurile de prelevare a probelor într-o exploatatie în relaţie cu repopularea1. Atunci când sunt reintrodusi porci într-o exploatatie, în concordanta cu art. 13 alin. (2) lit. b) sau cu art. 19 alin. (8) lit. b) din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice, trebuie să se aplice următoarele proceduri de prelevare a probelor:a) în cazul în care sunt reintrodusi porci santinela, probele de sânge pentru teste serologice trebuie prelevate în mod randomizat din fiecare subunitate a exploatatiei, de la un număr de porci ce permite detectarea unei prevalente de 10% cu o certitudine de 95%; … b) în cazul repopularii totale, probele de sânge pentru teste serologice trebuie prelevate în mod randomizat din fiecare subunitate a exploatatiei, de la un număr de porci care să permită detectarea unei seroprevalente de 20% cu o certitudine de 95%. Totuşi, în cazul scroafelor de reproducţie sau al vierilor, numărul probelor ce urmează să fie prelevate trebuie să permită detectarea unei seroprevalente de 10% cu o certitudine de 95%. … 2. După reintroducerea porcilor autoritatea veterinara competenţa trebuie să se asigure ca, în cazul oricărui caz de boala sau de moarte la porcii din exploatatie, din motive necunoscute, porcii în cauza sunt imediat testati pentru pesta porcina clasica. Aceste prevederi trebuie să se aplice până când în exploatatia în cauza sunt ridicate restricţiile la care se face referire la art. 13 alin. (2) lit. a) şi la art. 19 alin. (8) lit. b) din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice.F. Proceduri de prelevare a probelor în exploataţii din zona de protecţie, înainte de ridicarea restricţiilor1. Pentru a putea fi ridicate măsurile prevăzute în art. 10 din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice, într-o zona de protecţie, în toate exploatatiile din acea zonă trebuie:a) să fie efectuată o examinare conform procedurilor prevăzute la lit. A pct. 2 şi 3; … b) să fie prelevate probe de sânge pentru testele serologice, asa cum este menţionat la pct. 2. … 2. În fiecare subunitate din exploatatie numărul minim de probe de sânge ce urmează a fi prelevate trebuie să permită detectarea unei seroprevalente de 10% cu o certitudine de 95% la porci. Totuşi, în cazul:a) scroafelor pentru reproducţie, numărul minim al probelor ce urmează să fie prelevate trebuie să asigure detectarea unei seroprevalente de 5% cu o certitudine de 95%; … b) unui centru de colectare a spermei, trebuie prelevate probe de sânge de la toţi vierii. … G. Proceduri de prelevare a probelor în exploataţii din zona de supraveghere, înainte de ridicarea restrictiilor1. Pentru a putea fi ridicate restricţiile prevăzute la art. 11 din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice, într-o zona de supraveghere, trebuie să fie efectuată o examinare clinica în toate exploatatiile din zona, conform procedurilor prevăzute la lit. A pct. 2. În plus, trebuie să fie prelevate probe de sânge pentru teste serologice:a) de la porcii din toate exploatatiile în care nu sunt ţinuţi porci între 2 şi 8 luni; … b) când autoritatea veterinara competenţa considera ca pesta porcina clasica ar putea fi raspandita neobservat printre scroafele de reproducţie; … c) de la porcii din orice alta exploatatie în care prelevarea probelor este considerată necesară de către autoritatea veterinara competenţa; … d) de la porcii din toate centrele de colectare a spermei. … 2. Când este efectuată prelevarea probelor de sânge pentru teste serologice în exploataţii situate în zona de supraveghere, numărul probelor de sânge ce urmează a fi prelevate din aceste exploataţii trebuie să fie conform lit. F pct. 2. Totuşi, dacă autoritatea veterinara competenţa considera ca pesta porcina clasica ar putea fi raspandita neobservat printre scroafele de reproducţie, prelevarea probelor poate fi efectuată numai în subunitatile în care sunt ţinute aceste animale.H. Monitorizarea serologica şi procedurile de prelevare a probelor în zonele în care pesta porcina clasica este suspectata sau a fost confirmată la porci salbatici1. În cazul monitorizarii serologice la porci salbatici din zone în care pesta porcina clasica a fost confirmată sau este suspectata, mărimea şi zona geografică a populaţiei ţinta ce urmează a fi utilizata pentru prelevarea probelor trebuie să fie definite anticipat, pentru a se stabili numărul probelor ce urmează a fi prelevate. Dimensiunea probei trebuie să fie stabilită în funcţie de numărul estimat de animale vii, şi nu în funcţie de animalele impuscate.2. Dacă nu sunt disponibile date cu privire la densitatea şi dimensiunea populaţiei, zona geografică ce face obiectul prelevarii de probe trebuie să fie identificata ţinând cont de prezenta continua a porcilor salbatici şi de existenta barierelor naturale sau artificiale eficiente pentru a preveni deplasarea masiva şi continua a animalelor. Dacă nu apar aceste circumstanţe sau în cazul zonelor cu suprafeţe mari este recomandat să se identifice zone de prelevare a probelor de până la 200 kmp în care poate trai o populaţie de 400 până la 1.000 de porci salbatici.3. Fără a aduce atingere prevederilor art. 15 alin. (2) din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice, în cadrul zonei definite de prelevare a probelor, numărul minim de porci ce urmează a fi utilizaţi pentru aceasta operaţiune trebuie să permită detectarea unei seroprevalente de 5% cu o certitudine de 95%. În acest scop trebuie să fie utilizate pentru prelevare de probe cel puţin 59 de animale din fiecare zona identificata. Este, de asemenea, recomandat ca:a) în zonele în care presiunea de vânătoare este mai mare şi este realizată cu regularitate sau este efectuată vânătoarea selectiva ca o măsura de control, aproximativ 50% din animalele aparţinând clasei de vârsta între 3 luni şi 1 an, 35% aparţinând clasei de vârsta între 1 şi 2 ani şi 15% aparţinând clasei de vârsta mai mare de 2 ani trebuie să fie utilizate pentru prelevare de probe; … b) în zonele în care vânătoarea este rara sau absenta, cel puţin 32 de animale trebuie să fie utilizate pentru prelevare de probe, pentru fiecare dintre aceste clase de vârsta; … c) prelevarea de probe trebuie să fie efectuată într-o perioadă scurta, de preferat nu mai mare de o luna; … d) vârsta animalelor utilizate pentru prelevare de probe trebuie să fie stabilită în funcţie de eruptia dintilor. … 4. Colectarea probelor pentru teste virusologice de la porcii salbatici impuscati sau gasiti morţi trebuie să fie efectuată conform prevederilor cap. V lit. B pct. 1. Atunci când este considerată necesară monitorizarea virusologica a porcilor salbatici impuscati, aceasta trebuie să fie efectuată în primul rând pentru animalele în vârsta de 3 luni până la 1 an.5. Toate probele ce urmează să fie trimise la laborator trebuie să fie însoţite de chestionarul prevăzut la art. 16 alin. (7) din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice. + 
Capitolul 5Proceduri şi criterii generale pentru colectarea şi transportul probelorA. Proceduri şi criterii generale1. Înainte de efectuarea prelevarii de probe dintr-o exploatatie trebuie să fie realizată o harta a exploatatiei şi trebuie să fie identificate subunitatile epidemiologice ale acesteia.2. De fiecare data când se considera necesară o noua prelevare de probe de la porci, toţi porcii care sunt utilizaţi pentru aceasta operaţiune trebuie să fie unic marcati, astfel încât să fie uşor folosiţi în acest scop.3. Fără a aduce atingere prevederilor cap. IV lit. A pct. 5 lit. b), nu trebuie să fie prelevate probe pentru testarea serologica de la purcei mai mici de 8 săptămâni.4. Toate probele trebuie trimise la laborator, însoţite de documentele necesare, conform cerinţelor stabilite de autoritatea veterinara competenţa. Aceste documente vor include detalii despre istoricul porcilor utilizaţi pentru prelevare de probe şi semnele clinice sau leziunile post-mortem identificate. În cazul porcilor ţinuţi în exploataţii trebuie să fie disponibile informaţii clare cu privire la vârsta, categoria şi exploatatia de origine a porcilor utilizaţi pentru prelevare de probe. Este recomandat ca localizarea fiecărui porc utilizat pentru prelevare de probe în exploatatie să fie înregistrată împreună cu marca sa unica de identificare.B. Colectarea probelor pentru teste virusologice1. Pentru detectarea virusului, antigenului sau genomului virusului pestei porcine clasice de la porcii morţi sau eutanasiati, cele mai potrivite probe sunt tesuturile provenite din amigdale, splina şi rinichi. În plus este recomandat să se preleveze doua probe din alte tesuturi limfatice, cum ar fi limfonodulul retrofaringian, parotidian, mandibular sau mezenteric şi o proba din ileon. În cazul carcaselor autorizate este ales un os lung întreg sau sternul.2. Probe de sânge recoltate pe anticoagulant sau sangele coagulat trebuie prelevate de la porci care au prezentat semne de febra sau alte semne de boala, conform instrucţiunilor autorităţii veterinare competente.3. În cazul animalelor bolnave sunt recomandate teste virusologice. Acestea au de obicei o valoare limitată atunci când sunt utilizate în scopurile monitorizarii animalelor care nu prezintă semne clinice. Totuşi, dacă obiectivul unei prelevări de probe la scara larga este de a detecta virusul pestei porcine clasice, atunci când porcii sunt în perioada de incubaţie a bolii, amigdalele sunt cele mai adecvate probe.C. Transportul probelor1. Este recomandat ca toate probele:a) să fie transportate şi depozitate în containere închise ermetic; … b) sa nu fie inghetate, dar să fie păstrate reci, la temperatura de 0-4°C; … c) să fie expediate la laborator cat mai repede posibil; … d) să fie ţinute într-un pachet atunci când cuburi de gheaţa, altele decât cele de gheaţa carbonica, sunt folosite în interior pentru a le păstra reci; … e) tesuturile sau organele sunt puse într-o punga de plastic separată şi sigilată corespunzător. Acestea trebuie să fie apoi plasate în containere cu invelis extern puternic şi impachetate cu suficient material absorbant pentru a le proteja de deteriorare şi pentru a absorbi lichidul; … f) să fie transportate direct la laborator, când este posibil, de către personal autorizat, pentru a se asigura un transport rapid şi sigur. … 2. Exteriorul pachetului trebuie să fie etichetat cu adresa laboratorului destinatar şi următorul mesaj trebuie să fie evident înscris: "Material patologic animal. Perisabil. Fragil. A nu se deschide în afară unui laborator pentru pesta porcina clasica."3. Laboratorul care primeşte probele trebuie să fie informat înainte despre ora şi modul sosirii acestora.4. Pentru transportul aerian al probelor la Laboratorul Comunitar de Referinţa pentru Pesta Porcina Clasica*1) sau la laboratorul naţional de referinţa din tari terţe, pachetul trebuie să fie etichetat în concordanta cu reglementările IATA.––––-*1) Laboratorul Comunitar de Referinţa pentru Pesta Porcina Clasica are posibilităţi nelimitate de a primi probe pentru diagnostic şi izolarea virusului pestei porcine clasice. Copii de pe permisul de import pot fi solicitate de la laborator înainte de transport şi trebuie ataşate la exteriorul pachetului, într-un plic. + 
Capitolul 6Principiile şi utilizarea testelor virusologice şi evaluarea rezultatelor lorA. Detectarea antigenului viral1. Testul cu anticorpi fluorescenti (TAF)1.1. Principiul testului este detectarea antigenului viral din criosectiuni subtiri de material organic de la porci suspectati de a fi infectati cu virusul pestei porcine clasice. Antigenul intracelular este detectat prin utilizarea unui anticorp conjugat FITC. Un rezultat pozitiv trebuie să fie confirmat prin repetarea colorarii cu un anticorp monoclonal specific.1.2. Organele adecvate sunt amigdalele, rinichii, splina, diferiţi limfonoduli şi ileonul. Un frotiu din celulele maduvei spinarii poate fi, de asemenea, utilizat în cazul porcilor salbatici, caz în care aceste organe nu sunt disponibile sau sunt autolizate.1.3. Testul poate fi efectuat într-o zi. Aceste probe de organe pot fi obţinute doar de la animale moarte, utilizarea acestora fiind limitată doar pentru scopurile screening. Confidenta în rezultatul testului poate fi limitată de defectele de colorare, în special atunci când nu a fost obţinută experienta necesară în efectuarea testului sau dacă organele testate sunt autorizate.2. Testul ELISA pentru detectarea antigenului2.1. Antigenul viral este detectat utilizând diferite tehnici ELISA. Sensibilitatea testului ELISA pentru detectarea antigenului trebuie să fie suficient de mare pentru a indica un rezultat pozitiv la animale care prezintă semnele clinice de pesta porcina clasica.2.2. Utilizarea testului ELISA pentru detectarea antigenului este recomandată pentru probele de la animale cu semne clinice sau leziuni patologice de boala. Nu este recomandată pentru investigarea individuală a animalelor. Probele recoltate sunt leucocitele, serul sanguin, sangele necoagulat, precum şi suspensiile organelor la care se face referire la pct. 1, prelevate de la porci suspectati de a fi infectati cu virusul pestei porcine clasice*1).2.3. Testul ELISA poate fi efectuat într-o zi şi poate fi realizat prin echipament automat. Cel mai important avantaj este numărul mare de probe ce poate fi prelucrat într-o perioadă scurta. Este recomandat să fie utilizat acest test care da rezultate satisfăcătoare, pe material de referinţa. Totuşi în prezent toate testele ELISA sunt mai puţin sensibile decât izolarea virusului pe culturi celulare, iar sensibilitatea lor este semnificativ mai buna pe probe de sânge de la purcei decât pe cele de la porcii adulti.––––*1) În comerţ sunt disponibile câteva antigene ELISA ale pestei porcine clasice, care sunt validate cu diferite tipuri de probe.B. Izolarea virusului1. Izolarea virusului este bazată pe incubarea materialului proba pe culturi celulare sensibile de origine porcina. Dacă este prezent virusul pestei porcine clasice în proba, acesta se va replica în celule la un nivel care poate fi detectat, prin imunocolorarea celulelor infectate cu anticorpi conjugati. Anticorpii specifici pentru pesta porcina clasica sunt necesari pentru diagnosticul diferential faţă de alte pestivirusuri.2. Probele preferate pentru izolarea virusului pestei porcine clasice sunt leucocitele, plasma sanguina şi sangele integral obţinut din probe de sânge necoagulat sau organele la care se face referire la lit. A pct. 1.3. Izolarea virusului este mai potrivita pentru investigarea probelor de la un număr redus de animale decât pentru supraveghere. Procedura de izolare a virusului este laborioasa şi necesita cel puţin 3 zile pentru ca rezultatele să fie disponibile. Cel puţin doua pasaje de culturi celulare sunt necesare pentru a fi detectat un nivel redus al virusului în probe. Aceasta poate necesita un timp de investigare mai mare de 10 zile până a fi obţinut un rezultat final. Probele autolizate pot fi citotoxice pentru cultura celulara şi în consecinţa limitează utilizarea acestora.4. Acest test este recomandat pentru a se efectua izolarea virusului şi, de asemenea, în cazul confirmării anterioare a pestei porcine clasice prin alte metode. Acesta trebuie să fie utilizat ca test de referinţa pentru confirmarea rezultatelor pozitive anterioare, folosind metodele ELISA, PCT sau TAF, respectiv colorarea indirecta cu peroxidaza.Culturile de virus al pestei porcine clasice obţinute pe aceasta cale sunt utile pentru caracterizarea virusului, incluzând tipizarea genetica şi epidemiologia moleculara.5. Toate culturile de virus ale pestei porcine clasice din toate focarele iniţiale, de la primele cazuri de la porci salbatici sau de la cazurile din abatoare sau din mijloacele de transport, trebuie să fie tipizate genetic de către Laboratorul Naţional de Referinţa din România sau de Laboratorul Comunitar de Referinţa pentru Pesta Porcina Clasica, conform prevederilor lit. E.În orice caz aceste culturi de virus trebuie să fie trimise fără întârziere Laboratorului Comunitar de Referinţa pentru Pesta Porcina Clasica pentru colecţia de virus.C. Detectarea genomului viral1. Reactia de polimerizare în lant (PCR) este folosită pentru a se detecta genomul viral în probe de sânge, tesut sau organ. Fragmente mici ale ARN viral sunt transcrise în fragmente de ADN care apoi sunt amplificate de către PCR la cantităţi detectabile. Acest test detecteaza doar o secventa a genomului viral. PCR poate fi pozitiva chiar şi atunci când nu este prezent virusul (de exemplu, tesuturi lizate sau probe de la porcii convalescenti).2. PCR poate fi folosită pentru un număr mic de probe care au fost atent selectate de la animale suspecte sau din material de la fetusii avortati. Poate fi o metoda indicată pentru carcasele de porci salbatici, dacă materialul este autolizat şi nu este posibila izolarea virusului datorită citotoxicitatii.3. Materialul potrivit ca proba pentru diagnosticul prin PCR consta din organele descrise pentru izolarea virusului sau din sânge necoagulat.4. PCR poate fi realizată în 48 de ore. Este necesar un echipament de laborator adecvat, spaţii separate şi personal calificat. Un avantaj este ca particulele de virus nu au nevoie să fie replicate în laborator. Metoda este foarte sensibila, dar contaminarea se poate realiza uşor, ceea ce conduce la rezultate fals pozitive. De aceea sunt esenţiale proceduri stringente pentru controlul calităţii. Unele metode sunt specifice mai degraba pentru pestivirusuri decât pentru virusul pestei porcine clasice, necesitand teste de confirmare ulterioară, cum ar fi secventarea rezultatului PCR.D. Evaluarea rezultatelor testelor virusologice1. Testele virusologice sunt esenţiale pentru confirmarea pestei porcine clasice.1.1. Izolarea virusului trebuie să fie considerată ca test virusologic de referinţa care trebuie să fie utilizat ca test de confirmare, atunci când este necesar. Utilizarea acestuia este recomandată, în special, în cazul rezultatelor pozitive la IF, ELISA sau PCR ce nu sunt asociate cu detectarea semnelor clinice sau a leziunilor de boala şi în orice alt caz incert.1.2. Totuşi un focar primar de pesta porcina clasica poate să fie confirmat dacă au fost depistate semne clinice sau leziuni ale bolii la porcii în cauza şi cel puţin două teste de detectare a antigenului sau genomului au avut un rezultat pozitiv.1.3. Un focar secundar de pesta porcina clasica poate să fie confirmat dacă, în plus faţă de aspectele de corelatie epidemiologica cu un focar sau caz confirmat, au fost detectate semne clinice sau leziuni ale bolii la porcii în cauza sau un test de detectare a antigenului ori a genomului a avut un rezultat pozitiv.1.4. Poate fi confirmat un caz primar de pesta porcina clasica la porcii salbatici după izolarea virusului sau dacă a fost obţinut un rezultat pozitiv la cel puţin două teste de detectare a antigenului sau a genomului. Cazurile ulterioare de pesta porcina clasica la porcii salbatici, pentru care a fost determinata o legătură epidemiologica cu cazurile confirmate anterior, pot fi confirmate dacă un test de detectare a antigenului sau a genomului a dat un rezultat pozitiv.2. Un rezultat pozitiv pentru pesta porcina clasica la un test de detectare a antigenului sau a genomului necesita ca testul în cauza sa fi fost realizat folosindu-se anticorpi specifici pentru virusul pestei porcine clasice sau primeri. Dacă testul utilizat nu a fost specific pentru virusul pestei porcine clasice, dar a fost specific doar pentru pestivirusuri, acest test trebuie să fie repetat utilizându-se reagenti specifici pentru pesta porcina clasica.E. Tipizarea genetica a culturilor virusului pestei porcine clasice1. Tipizarea genetica a culturilor virusului pestei porcine clasice este realizată prin determinarea secventei de nucleotide a unei porţiuni a genomului viral şi prin dispunerea părţilor specifice ale segmentului 5 necodificat şi/sau a genei glicoproteinei E(2). Similaritatea acestor secvente cu cele deja obţinute de la culturile virale anterioare poate indica dacă focarele de boala sunt sau nu cauzate de tulpini noi ori deja recunoscute. Aceasta poate susţine sau infirma ipoteza cu privire la căile de transmitere care au fost presupuse de ancheta epidemiologica. Tipizarea genetica a culturilor virusului pestei porcine clasice este de o importanţa majoră pentru a se determina sursa bolii. Totuşi o relaţie strânsă între tulpinile de virus obţinute din diferite focare de boala nu este o dovadă absolută pentru o legătură epidemiologica directa.2. Dacă tipizarea virusului nu poate fi efectuată într-un laborator naţional sau în orice alt laborator autorizat pentru diagnosticul pestei porcine clasice într-o perioadă scurta, proba originala sau cultura virala trebuie să fie trimisa cat mai repede posibil Laboratorului Comunitar de Referinţa pentru Pesta Porcina Clasica pentru tipizare.2.1. Datele cu privire la tipizare şi secventarea tulpinilor virusului pestei porcine clasice, disponibile în laboratoarele autorizate pentru diagnosticul acesteia, trebuie să fie trimise Laboratorului Comunitar de Referinţa pentru Pesta Porcina Clasica, pentru ca aceste informaţii să fie introduse în baza de date deţinută de acest laborator.2.2. Informaţiile incluse în aceasta baza de date trebuie să fie disponibile tuturor laboratoarelor naţionale de referinţa din statele membre ale Uniunii Europene şi din România. Totuşi, în scopul publicării în jurnale ştiinţifice, dacă este solicitat de laboratorul naţional în cauza, Laboratorul Comunitar de Referinţa pentru Pesta Porcina Clasica trebuie să garanteze confidenţialitatea acestor date până când acestea sunt publicate. + 
Capitolul 7Principiile şi utilizarea testelor serologice şi evaluarea rezultatelor acestoraA. Principii de bază şi valoarea de diagnostic1. La porcii infectati cu virusul pestei porcine clasice anticorpii sunt de obicei detectati în probele de ser la 2-3 săptămâni după infectie. La porcii care sunt refacuti după boala anticorpii de neutralizare protectori pot fi detectati pentru cativa ani sau chiar pe tot parcursul vieţii. Anticorpii sunt, de asemenea, detectati sporadic în stadiul terminal al animalelor bolnave. La unii porci cu forma cronica de pesta porcina clasica pot fi detectati anticorpii pentru câteva zile, la sfârşitul primei luni de după infectie. Purceii infectati intrauterin pot să fie imunotoleranti împotriva virusului omolog al pestei porcine clasice şi dezvolta anticorpi nespecifici. Totuşi anticorpi de origine maternala pot fi detectati în timpul primelor zile de viaţa. Timpul de injumatatire a anticorpilor maternali la purceii sanatosi neviremici este de aproximativ doua săptămâni. Dacă se găsesc anticorpi ai pestei porcine clasice la purcei mai mari de 3 luni, este puţin probabil ca aceştia să fie de origine maternala.2. Detectarea anticorpilor împotriva virusului pestei porcine clasice în probe de sânge sau plasma sanguina este efectuată pentru a ajuta diagnosticul pestei porcine clasice în exploatatiile suspecte, pentru stabilirea perioadei de la infectare în cazul focarelor confirmate şi pentru scopurile monitorizarii şi supravegherii. Totuşi testele serologice sunt de valoare limitată pentru detectarea pestei porcine clasice într-o exploatatie, în cazul unei infectii recente. Cativa porci seropozitivi cu un titru scăzut la titrul de neutralizare pot să fie indicatori ai unei infectii recente (2-4 săptămâni). Mulţi porci cu titru mare la titrul de neutralizare pot indica intrarea în exploatatie a virusului cu mai mult de o luna înainte. Pozitionarea porcilor seropozitivi în exploatatie poate furniza informaţii valabile privind introducerea virusului pestei porcine clasice în exploatatie. Totuşi trebuie să fie efectuată o evaluare adecvată a rezultatelor testelor serologice, ţinând cont de toate constatările clinice, virusologice şi epidemiologice, în cadrul anchetei ce trebuie să fie realizată în cazul suspectarii sau confirmării pestei porcine clasice, în concordanta cu art. 8 din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice.B. Teste serologice recomandate1. Testul de virus neutralizare (TVN) şi ELISA sunt testele cele mai indicate pentru diagnosticul serologic al pestei porcine clasice. Calitatea şi eficacitatea diagnosticului serologic efectuat de laboratoarele naţionale de referinţa trebuie să fie verificate cu regularitate în cadrul testelor comparative interlaboratoare organizate periodic de Laboratorul Comunitar de Referinţa pentru Pesta Porcina Clasica.2. TVN este bazat pe determinarea activităţii de neutralizare a anticorpilor antivirali din probe de ser, exprimat ca punct final de neutralizare de 50%. O cantitate constanta de virus al pestei porcine clasice este incubata la 37°C cu ser diluat. În scopul efectuării screeningului serul este iniţial diluat 1/10. Atunci când este necesară o titrare completa, pot fi realizate doua dilutii ale serului începând cu 1/2 sau 1/5. Fiecare dilutie este amestecata cu un volum egal de suspensie de virus conţinând 100 de doze infectioase. După incubare amestecul este inoculat în culturi celulare care sunt incubate 3-5 zile. După această perioadă de incubaţie culturile sunt fixate şi orice replicare virala în celulele infectate este detectata de un sistem imun de etichetare. Pot fi folosite atât testul de neutralizare a anticorpilor legaţi de peroxidaza (NPLA), cat şi testul de neutralizare-imunofluorescenta (NIF). Rezultatele TVN sunt exprimate ca reciproce ale dilutiei iniţiale a serului la care jumătate din culturile celulare inoculate (50% punct final) nu reuşesc sa indice replicarea virala (nu este etichetare specifică). Este estimat ca un punct între doua niveluri de dilutie. Sistemul final de dilutie este bazat pe dilutia actuala a serului în timpul reacţiei de neutralizare (de exemplu, după adăugarea virusului, dar înainte de adăugarea suspensiei celulare).3. TVN este cel mai sensibil şi sigur test pentru detectarea anticorpilor împotriva virusului pestei porcine clasice. De aceea acesta este recomandat pentru examinarea serologica a unui singur animal, precum şi pentru un lot. Totuşi prin acest test pot fi detectati anticorpii pentru neutralizare incrucisata specifici infectarii porcilor cu pestivirusuri pentru rumegatoare. TVN pentru detectarea anticorpilor împotriva virusului BVD şi a virusului BD urmează aceleaşi principii menţionate mai sus şi sunt realizate pentru diagnosticul diferential al pestei porcine clasice.4. Tulpinile de pestivirusuri ce trebuie utilizate în testele de neutralizare trebuie să fie în concordanta cu recomandarea Laboratorului Comunitar de Referinţa pentru Pesta Porcina Clasica.5. Au fost perfectate câteva tehnici ELISA ce folosesc anticorpi monoclonali specifici, care sunt bazate pe doua variante: ELISA competitiv sau de blocare şi ELISA necompetitiv. ELISA competitiv sau de blocare este de obicei bazat pe anticorpi monoclonali. Dacă proba de ser conţine anticorpi ai virusului clasic, legătură unui anticorp monoclonal selectat conjugat cu peroxidaza la antigenul viral va fi inhibata, rezultând un semnal redus. În testul ELISA necompetitiv legătură anticorpilor din ser cu antigenul viral este masurata direct, utilizându-se anticorpi antiporc conjugati la peroxidaza.6. Controlul calităţii cu privire la sensibilitatea şi specificitatea fiecărui lot de ELISA trebuie să fie efectuat în mod regulat de către laboratoarele naţionale, folosindu-se lista serurilor de referinţa prevăzută de Laboratorul Comunitar de Referinţa pentru Pesta Porcina Clasica. Aceasta lista va cuprinde:a) ser de la porci în prima faza de infectare cu virusul pestei porcine clasice (înainte de 21 de zile de la infectare); … b) ser de la porcii convalescenti (după 21 de zile de la infectare); … c) ser de la porci infectati cu pestivirusuri ale rumegatoarelor. … Testul ELISA ce urmează a fi utilizat pentru diagnosticul serologic al pestei porcine clasice trebuie să recunoască toate serurile de referinţa de la porcii în convalescenta. Toate rezultatele obţinute cu seruri de referinţa trebuie să fie repetabile. Este, de asemenea, recomandat ca acestea sa detecteze toate serurile pozitive provenite de la porci în faza iniţială a bolii şi să prezinte o minima reactie de incrucisare cu serurile de la porcii infectati cu pestivirusuri ale rumegatoarelor. Rezultatele obţinute cu seruri de la porci în faza iniţială a infectiei indica sensibilitatea testului ELISA.7. Sensibilitatea testului ELISA este evaluată ca fiind mai mica decât a TVN şi se recomanda ca aceasta să fie folosită ca un test screening aplicat la un lot de porcine. Totuşi testul ELISA necesita facilităţi mai puţin specializate şi poate fi realizat mult mai rapid, graţie sistemului automatic, spre deosebire de TVN. Testul ELISA poate să asigure identificarea tuturor cazurilor de infectie cu virusul pestei porcine clasice în stadiul de convalescenta şi implica faptul de a fi cat de liber posibil de interferenta prin reactiile incrucisate prin anticorpi cu pestivirusurile rumegatoarelor.C. Interpretarea rezultatelor serologice şi diagnosticul diferential cu infectii datorate pestivirusurilor rumegatoarelor (BVDV şi BDV)1. Fără a aduce atingere prevederilor art. 4 alin. (3) sau ale art. 7 alin. (2) din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice, în cazul depistarii unui titru de neutralizare a virusului pestei porcine mai mare de 10 ND(50) la probe de ser sanguin prelevate de la unul sau mai mulţi porci sau a unui rezultat pozitiv la testul ELISA la probe de ser sanguin provenite de la un grup de porci trebuie să fie aplicate imediat în exploatatia vizata măsurile prevăzute în art. 4 alin. (2) din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice sau trebuie să se continue aplicarea acestora. Probele deja prelevate din aceasta exploatatie trebuie să fie retestate prin TVN, prin titrarea comparativa a dilutiei finale a anticorpilor neutralizanti ai virusului pestei porcine clasice şi a pestivirusurilor rumegatoarelor.2. Dacă testele comparative evidenţiază anticorpi faţă de pestivirusurile rumegatoarelor şi un titru de anticorpi în mod evident mai scăzut (mai puţin de 3 ori) faţă de virusul pestei porcine clasice, suspiciunea de pesta porcina clasica trebuie să fie exclusa, în afară de cazul în care exista alte motive care garantează aplicarea continua a măsurilor la care se face referire la art. 4 alin. (2) din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice, în exploatatia vizata.3. Dacă testele comparative evidenţiază la mai mulţi porci un titru de virus neutralizare mai mare sau egal cu 10 ND(50), iar acest titru este mai mare sau egal cu titrurile faţă de alte pestivirusuri, autoritatea veterinara centrala a României trebuie să se asigure ca pesta porcina clasica va fi confirmată, cu condiţia ca în exploatatia vizata sa fi fost constatate dovezi epidemiologice ale bolii.4. Fără a aduce atingere prevederilor art. 4 alin. (3) din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice, dacă nu s-au constatat dovezi epidemiologice ale bolii sau dacă rezultatele testelor precedente nu sunt concludente, autoritatea veterinara locală trebuie să se asigure ca în exploatatia vizata:a) se va continua aplicarea măsurilor prevăzute la art. 4 alin. (2) din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice; … b) sunt efectuate investigaţii ulterioare, cat mai curând posibil, pentru a se confirma sau a se exclude existenta pestei porcine clasice, conform cap. IV. … 5. Totuşi controalele ulterioare şi testele prevăzute la pct. 4 nu permit excluderea pestei porcine clasice, fiind necesară efectuarea unor prelevări de probe ulterioare, pentru testarea serologica a porcilor din exploatatie, după ce trec cel puţin două săptămâni de la controlul precedent. În cadrul acestei prelevări ulterioare de probe, porcii de la care deja s-au recoltat probe şi care sunt deja testati trebuie să fie retestati, pentru o testare serologica comparativa cu probele prelevate anterior, în vederea depistarii seroconversiei pentru virusul pestei porcine clasice sau pentru pestivirusurile rumegatoarelor. Dacă aceste controale şi teste ulterioare nu permit confirmarea pestei porcine clasice, măsurile prevăzute la art. 4 din Norma sanitară veterinara privind măsurile de control al pestei porcine clasice pot fi ridicate. + 
Capitolul 8Teste discriminatorii în cazul vaccinarii de urgentaNu exista încă teste discriminatorii disponibile pentru a se distinge porcii vaccinati de porcii infectati natural cu virusul pestei porcine clasice. Pe măsura ce aceste teste devin disponibile, ele vor fi introduse pentru a fi utilizate în programul de supraveghere anual. + 
Capitolul 9Cerinţe minime de protecţie pentru laboratoarele de depistare a pestei porcine clasice1. Cerinţele minime prevăzute în tabelul nr. 1 trebuie să fie îndeplinite de oricare laborator în care urmează să fie manipulat virusul pestei porcine clasice, chiar şi numai într-o cantitate mica, asa cum solicita testele de izolare şi neutralizare a virusului. Examinarile post-mortem şi prelucrarea tesuturilor pentru testul serologic cu anticorpi fluorescenti, la care se folosesc antigene inactivate, pot fi efectuate la un nivel de contaminare mai scăzut, cu condiţia să se aplice dezinfectiile igienice de baza şi cele postoperationale, împreună cu evacuarea în siguranţa a deşeurilor de tesuturi şi seruri.2. Cerinţele suplimentare prevăzute în tabelul nr. 1 trebuie să fie îndeplinite de către orice laborator în care sunt efectuate proceduri care implica multiplicarea extensiva a virusului.3. Cerinţele prevăzute în tabelul nr. 2 trebuie să fie îndeplinite de către orice laborator în care sunt efectuate experimente pe animale infectate cu virusul pestei porcine clasice.4. În orice caz, toate stocurile de virus al pestei porcine clasice trebuie să fie ţinute într-un depozit sigur, fie congelate, fie liofilizate. Se recomanda ca frigiderele şi congelatoarele sa nu fie folosite pentru alte virusuri în afară virusului pestei porcine sau pentru alte materiale care nu au legătură cu diagnosticul pestei porcine clasice. Toate fiolele trebuie să fie etichetate individual şi trebuie să se ţină evidenta stocurilor de virusuri, împreună cu datele şi rezultatele controalelor de calitate. Trebuie, de asemenea, să se ţină evidente ale virusurilor adăugate la stoc, împreună cu detalii privind sursa acestora, precum şi a virusurilor livrate altor laboratoare.5. Se recomanda ca unitatea de biosecuritate pentru efectuarea lucrărilor cu virusul pestei porcine clasice să fie inconjurata de spaţii în care nu se manipuleaza virusul menţionat. Aceste spaţii trebuie să fie disponibile pentru prepararea sticlariei şi mediilor de cultura, menţinerea şi prepararea culturilor de celule neinfectate, prepararea serurilor şi testarilor serologice (altele decât metodele care folosesc virusul viu al pestei porcine clasice) şi pregătirea suportului administrativ şi de birou.    Tabelul nr. 1              Principii ale controlului biologic corespunzător                    pentru laboratoarele de diagnostic

    Tabelul nr. 2    Cerinţe de biosecuritate pentru camerele de experienţe pe animale

––––-

	Redacția Lex24 Drept la Sursa!
	Articole Urmărește