NORMĂ SANITARĂ VETERINARĂ din 1 februarie 2007

ce stabileşte metode comunitare de analiză pentru determinarea vitaminei A, a vitaminei E şi a triptofanului din furaje



 + 
Articolul 1Autoritatea veterinară centrală a României trebuie să solicite ca analizele efectuate în scopul controalelor oficiale pentru determinarea conţinutului de vitamina A, vitamina E şi triptofan al furajelor şi premixurilor să fie efectuate folosindu-se metoda stabilită în anexa la prezenta normă sanitară veterinară. + 
Articolul 2Autoritatea veterinară centrală a României informează Comisia Europeană cu privire la actele normative şi prevederile administrative necesare pentru implementarea prezentei norme sanitare veterinare. + 
Articolul 3Anexa face parte integrantă din prezenta normă sanitară veterinară. + 
Anexa la norma sanitară veterinară + 
Partea A: Determinarea vitaminei A (retinol)1. Scop şi domeniuAceastă metodă se foloseşte pentru determinarea vitaminei A (retinol) din furaje şi premixuri. Vitamina A include toţi compuşii alcool trans-retinol şi izomerii cis. Conţinutul de vitamina A este exprimat în unităţi internaţionale (UI)/kg. O unitate internaţională corespunde activităţii a 0,300 æg a tuturor compuşilor alcoolici trans ai vitaminei A sau 0,344 æg a tuturor compuşilor acetaţi trans ai vitaminei A ori 0,550 æg a tuturor compuşilor palmitaţi trans ai vitaminei A. Limita de determinare este de 2.000 UI vitamina A/kg.2. Principiul metodeiProba este hidrolizată cu soluţie etanolică de hidroxid de potasiu, iar vitamina A este extrasă în eter de petrol. Solventul este înlăturat prin evaporare, iar reziduul este diluat în metanol şi, dacă este necesar, diluat până la concentraţia necesară. Conţinutul de vitamina A este determinat prin lichid cromatografie de înaltă performanţă cu fază inversă (RP-HPLC), folosindu-se un detector cu UV sau cu fluorescentă. Parametrii cromatografici sunt aleşi astfel încât să nu existe nicio diferenţă între toţi compuşii alcoolici trans ai vitaminei A şi izomerii cis.3. Reactivi:3.1. Etanol, c = 96%, anhidru3.2. Eter de petrol, interval de fierbere 40°-60°C3.3. Metanol3.4. Soluţie de hidroxid de potasiu, â = 50 g/100 ml3.5. Soluţia de ascorbat de sodiu, â = 10 g/100 ml (a se vedea observaţiile de la pct. 7.7)3.6. Sulfit de sodiu, Na(2)S x H(2)O (x = 7-9)3.6.1. Soluţie de sulfit de sodiu, c = 0,5 mol/l în glicerol, â = 120 g/l (pentru x = 9) (a se vedea observaţiile de la pct. 7.8)3.7. Soluţie de fenoftaleină, â = 2 g/100 ml în etanol (pct. 3.1)3.8. 2-Propanol3.9. Faza mobilă pentru HPLC: amestec de metanol (pct. 3.3) şi apă, de exemplu 980 + 20 (v + v). Raportul exact trebuie determinat prin intermediul caracteristicilor coloanei folosite.3.10. Azot, liber de oxigen3.11. Acetat de vitamina A trans total, extrapur, cu activitate certificată, de exemplu 2,80 x 10^6 UI/g3.11.1. Soluţie stoc din vitamina A acetat trans total: se cântăresc, cu aproximaţie de 0,1 mg, 50 mg din acetat de vitamina A (pct. 3.11) într-un balon cotat de 100 ml. Se dizolvă în 2-propanol (pct. 3.8) şi se completează până la semn cu acelaşi solvent. Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 1.400 UI vitamina A/ml. Conţinutul exact trebuie determinat în conformitate cu pct. 5.6.3.1.3.12. Palmitat de vitamina A, extrapur, cu activitate certificată, de exemplu 1,80 x 10^6 UI/g3.12.1. Soluţie stoc din retinol palmitat trans total: se cântăresc, cu aproximaţie de 0,1 mg, 80 mg din palmitat de vitamina A (pct. 3.12) într-un balon cotat de 100 ml. Se dizolvă în 2-propanol (pct. 3.8) şi se completează până la semn cu acelaşi solvent. Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 1.400 UI vitamina A/ml. Conţinutul exact trebuie determinat în conformitate cu pct. 5.6.3.2.3.13. 2,6-di-tert-butil-4-metilfenol (BHT) (a se vedea observaţiile de la pct. 7.5).4. Aparatură:4.1. Evaporator rotativ cu vacuum4.2. Sticlărie brună4.2.1. Baloane cu fund plat sau conice de 500 ml, cu şlif4.2.2. Baloane cotate cu dopuri rodate, cu gât îngust, cu capacitate de 10, 25, 100 şi 500 ml4.2.3. Pâlnii de separare, conice, de 1.000 ml, cu dopuri din sticlă4.2.4. Baloane piriforme din sticlă de 250 ml cu şlif4.3. Condensator Allihn, de 300 mm, cu legătură din sticlă, cu adaptator pentru o pipă de aprovizionare cu gaz4.4. Hârtie de filtru pentru separarea fazică, cu diametrul de 185 mm (de exemplu Schleicher amp; Schuell 597 HY(1/2) sau similar)4.5. Lichid cromatografie de înaltă presiune (echipament HPLC cu sistem de injecţie)4.5.1. Coloană de lichid cromatografie, 250 mm x 4 mm, C(18), de 5 sau 10 æm sau echivalent (criteriu de performanţă: doar un singur peak pentru toţi izomerii retinolului în baza condiţiilor HPLC)4.5.2. Detector UV sau de fluorescentă, cu ajustare variabilă a lungimii de undă4.6. Spectrofotometru cu cuve de cuarţ de 10 mm4.7. Baie de apă cu agitator magnetic4.8. Aparat de extracţie ce constă din:4.8.1. Cilindru de sticlă cu capacitate de 1 l, echipat cu gât şi dop rodat;4.8.2. Mufă rodată, echipată cu un braţ exterior şi un tub ajustabil ce trece prin centru. Tubul ajustabil trebuie să aibă un capăt în formă de U în partea de jos şi o parte efilată la partea opusă, astfel încât stratul superior de lichid din cilindru să poată fi transferat într-un tub de separare.5. ProcedurăNOTĂ:Vitamina A este sensibilă la lumină (UV) şi oxidare. Toate operaţiunile trebuie efectuate în absenţa luminii (folosindu-se sticlărie brună sau sticlărie protejată cu folie de aluminiu) şi a oxigenului (a se purja cu azot). În timpul extracţiei aerul de deasupra lichidului trebuie înlocuit cu azot (evitaţi presiunea în exces prin lărgirea dopului din când în când).5.1. Pregătirea probeiSe mărunţeşte proba astfel încât să treacă printr-o sită cu ochiuri de 1 mm, avându-se grijă să se evite generarea de căldură. Mărunţirea trebuie efectuată imediat înainte de cântărire şi saponificare, altfel ar putea avea loc pierderi de vitamina A.5.2. SaponificareaÎn funcţie de conţinutul de vitamina A, se cântăresc, cu aproximaţie de 0,01 g, 2 până la 25 g din probă, într-un balon de 500 ml cu fundul plat sau conic (pct. 4.2.1). Se adaugă în continuare, prin amestecare, 130 ml etanol (pct. 3.1), aproximativ 100 mg BHT (pct. 3.13), 2 ml soluţie de ascorbat de sodiu (pct. 3.5) şi 2 ml soluţie de sulfit de sodiu (pct. 3.6). Se potriveşte un condensator (pct. 4.3) la balon şi se scufundă balonul într-o baie de apă cu agitator magnetic (pct. 4.7). Se încălzeşte până la fierbere şi se lasă la reflux timp de 5 minute. Se adaugă apoi 25 ml soluţie de hidroxid de potasiu (pct. 3.4) prin condensator (pct. 4.3) şi se lasă la reflux timp de 25 de minute, agitându-se sub un flux uşor de azot. Apoi se clăteşte condensatorul cu aproximativ 20 ml apă şi se răceşte conţinutul balonului la temperatura camerei.5.3. ExtracţieSe transferă prin decantare întreaga soluţie saponificată, prin clătire cu un volum total de 250 ml apă într-o pâlnie de separare de 1.000 ml (pct. 4.2.3) sau în aparatul de extracţie (pct. 4.8). Se clăteşte balonul de saponificare în continuare cu 25 ml etanol (pct. 3.1) şi 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) şi se transferă soluţiile de clătire în pâlnia de separare sau în aparatul de extracţie. Proporţia de apă şi etanol în soluţiile combinate ar trebui să fie de 2:1. Se agită viguros timp de două minute şi se lasă să se sedimenteze timp de două minute.5.3.1. Extracţie folosind un tub de separare (pct. 4.2.3)Când straturile de lichid s-au separat (a se vedea observaţia de la pct. 7.3), se transferă stratul de eter de petrol într-o altă pâlnie de separare (pct. 4.2.3). Se repetă această extracţie de două ori, cu 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) şi de două ori cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2). Se spală extractele combinate în pâlnia de separare, de două ori, prin amestecare uşoară – pentru a se evita formarea emulsiilor – cu cantităţi de 100 ml apă şi după agitare repetată alte cantităţi de 100 ml apă, până când apa rămâne incoloră la adăugarea soluţiei de fenoftaleină (pct. 3.7) – spălarea de patru ori este suficientă. Se filtrează extractul spălat printr-un filtru de hârtie pentru separare fazică (pct. 4.4), pentru a se înlătura orice cantitate de apă în suspensie, într-un balon cotat de 500 ml (pct. 4.2.2). Se spală pâlnia de separare şi filtrul cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2), se umple până la semn cu eter de petrol (pct. 3.2) şi se amestecă bine.5.3.2. Extracţie folosind un aparat de extracţie (pct. 4.8)Când straturile s-au separat (a se vedea observaţia de la pct. 7.3), se înlocuieşte dopul cilindrului de sticlă (pct. 4.8.1) prin inserţie din sticlă mată (pct. 4.8.2) şi se aranjează capătul de mai jos în formă de U al tubului ajustabil, astfel încât să se afle deasupra nivelului interfeţei. Prin aplicarea unei presiuni de la generatorul de azot prin braţul exterior, se transferă stratul superior de eter de petrol într-un tub de separare de 1.000 ml (pct. 4.2.3). Se adaugă 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) în cilindrul de sticlă (al aparatului), se ataşează dopul şi se agită bine. Se lasă straturile să se separe şi se transferă stratul de deasupra în tubul de separare, la fel ca înainte. Se repetă procedura extracţiei cu încă 100 ml eter de petrol (pct. 3.2), apoi de două ori cu cantităţi de 50 ml eter de petrol (pct. 3.2) şi se adaugă straturile de eter de petrol în tubul de separare. Se spală extractele combinate din eter de petrol, după cum este descris la pct. 5.3.1, şi se procedează după cum este descris la acel punct.5.4. Prepararea soluţiei probă pentru HPLCSe pipetează o cantitate alicotă din soluţia de eter de petrol (de la pct. 5.3.1 la pct. 5.3.2) într-un balon în formă de pară de 250 ml (pct. 4.2.4). Se evaporă solventul până aproape de sec, la evaporatorul rotativ (pct. 4.1), cu presiune redusă, la o temperatură a băii de apă ce nu depăşeşte 40°C. Se restabileşte presiunea atmosferică prin admisie de nitrogen (pct. 3.10) şi se îndepărtează balonul de pe evaporatorul rotativ. Se înlătură solventul rămas în curent de azot (pct. 3.10) şi se dizolvă imediat reziduul cu un volum cunoscut (10-100 ml) de metanol (pct. 3.3) (concentraţia de vitamina A trebuie să fie între 5 UI/ml şi 30 UI/ml).5.5. Efectuarea determinării prin HPLCVitamina A este separată pe o coloană C(18) cu fază inversă (pct. 4.5.1), iar concentraţia este măsurată printr-un detector de UV (325 nm) sau un detector de fluorescentă (excitaţie: 325 nm, emisie: 475 nm) (pct. 4.5.2). Se injectează o cantitate alicotă (de exemplu 20 æl) de soluţie metanolică obţinută conform pct. 5.4 şi se eluează cu faza mobilă (pct. 3.9). Se calculează media peak-urilor înălţimii mai multor injecţii din aceeaşi soluţie de probă şi media peak-urilor înălţimii mai multor injecţii ale soluţiilor de calibrare (pct. 5.6.2).Condiţii de separare HPLCSunt oferite următoarele condiţii pentru instruire; pot fi folosite alte condiţii, cu obligaţia ca acestea să ofere rezultate echivalente.Coloana de lichid cromatografie (pct. 4.5.1): 250 mm x 4 mm, C(18) de 5 sau 10 æm ori echivalentFaza mobilă (pct. 3.9): amestec de metanol (pct. 3.3) şi apă, de exemplu 980 + 20 (v + v)Rata de curgere: 1-2 ml/min.Detector (pct. 4.5.2): detector cu UV (325 nm) sau detector cu fluorescentă (excitaţie: 325 nm/emisie: 475 nm)5.6. Calibrare5.6.1. Prepararea soluţiilor standard de lucruSe pipetează 20 ml soluţie stoc de acetat vitamina A (pct. 3.11) sau 20 ml soluţie stoc de palmitat vitamina A (pct. 3.12.1) într-un balon cu fund plat sau conic (pct. 4.2.1) şi se hidrolizează după cum este descris la pct. 5.2, dar fără a se adăuga BHT. Se aplică apoi extracţia cu eter de petrol (pct. 3.2) în conformitate cu pct. 5.3 şi se completează până la 500 ml cu eter de petrol (pct. 3.2). Se evaporă 100 ml din acest extract pe evaporatorul rotativ (a se vedea pct. 5.4) până aproape de sec, se înlătură solventul rămas cu un curent de azot (pct. 3.10) şi se redizolvă reziduul în 10,0 ml metanol (pct. 3.3). Concentraţia nominală a acestei soluţii este 560 UI vitamina A/ml. Conţinutul exact trebuie determinat în conformitate cu pct. 5.6.3.3. Soluţia standard de lucru trebuie preparată proaspătă, înainte de folosire. Se pipetează 2,0 ml din această soluţie standard de lucru, într-un balon cotat de 20 ml, se completează cu metanol până la semn (pct. 3.3) şi se amestecă. Concentraţia nominală a acestei soluţii standard de lucru diluate este de 56 UI de vitamina A/ml.5.6.2. Prepararea soluţiilor de calibrare şi a graficului de calibrare: se transferă 1,0; 2,0; 5,0 şi 10,0 ml din soluţia standard de lucru, diluată într-o serie de baloane cotate de 20 ml, se completează până la semn cu metanol (pct. 3.3) şi se amestecă. Concentraţiile nominale ale acestor soluţii sunt 2,8; 5,6; 14,0 şi 28,6 UI de vitamina A/ml. Se injectează 20 æl din fiecare soluţie de calibrare de mai multe ori şi se determină media înălţimilor peack-urilor. Folosindu-se media înălţimilor peack-urilor, se întocmeşte o curbă de calibrare, luându-se în considerare rezultatele obţinute în UV (pct. 5.6.3.3).5.6.3. Standardizarea UV a soluţiilor standard5.6.3.1. Soluţie stoc acetat de vitamina ASe pipetează 2,0 ml din soluţia stoc acetat de vitamina A (pct. 3.11.1) într-un balon cotat de 50 ml (pct. 4.2.2) şi se completează până la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 56 UI vitamina A/ml. Se pipetează 3,0 ml din această soluţie de acetat de vitamina A într-un balon cotat de 25 ml şi se completează până la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 6,72 UI vitamina A/ml. Se măsoară spectrul UV al acestei soluţii faţă de 2-propanol (pct. 3.8) cu un spectrofotometru (pct. 4.6), la o lungime de undă între 300 nm şi 400 nm. Extincţia maximă trebuie să fie între 325 nm şi 327 nm.Calcularea conţinutului de vitamina A:UI vitamina A/ml = E(326) x 19,0[E(1cm)^1% pentru vitamina A acetat = 1.530 la 326 nm în 2-propanol]5.6.3.2. Palmitatul de vitamina A soluţia stocSe pipetează 2,0 ml de vitamina A palmitat din soluţia stoc (pct. 3.12.1) într-un balon cotat de 50 ml (4.2.2) şi se completează până la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 56 UI vitamina A/ml. Se pipetează 3,0 ml din această soluţie diluată de vitamina A palmitat într-un balon cotat de 25 ml şi se completează până la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 6,72 UI vitamina A/ml. Se măsoară spectrul UV al acestei soluţii faţă 2-propanolului (pct. 3.8) cu spectrofotometrul (pct. 4.6) fixat la o lungime de undă între 300 nm şi 400 nm. Extincţia maximă trebuie să fie între 325 nm şi 327 nm.Calcularea conţinutului de vitamina A:UI vitamina A/ml = E(326) x 19,0[E(1cm)^1% pentru vitamina A palmitat = 1.530 la 326 nm în 2-propanol]5.6.3.3. Vitamina A = Soluţie standard de lucru. Se pipetează 3,0 ml din soluţia standard de vitamina A nediluată, preparată în conformitate cu pct. 5.6.1, într-un balon cotat de 50 ml (pct. 4.2.2) şi se completează până la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Se pipetează 5 ml din această soluţie într-un balon cotat de 25 ml şi se aduce la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 6,72 UI de vitamina A/ml. Se măsoară spectrul acestei soluţii faţă de 2-propanol (pct. 3.8) cu spectrofotometrul (pct. 4.6) la lungime de undă între 300 nm şi 400 nm. Extincţia maximă trebuie să fie între 325 nm şi 327 nm.Calcularea conţinutului în vitamina A:UI vitamina A/ml = E(325) x 18,3[E(1cm)^1% pentru retinol = 1.821 la 325 nm în 2-propanol]6. Calcularea rezultatelorPornindu-se de la înălţimea medie a peak-urilor de vitamina A a soluţiei de probă, se determină concentraţia soluţiei de probă în UI/ml, prin referire faţă de curba de calibrare (pct. 5.6.2).Conţinutul w de vitamina A în UI/kg al probei este dat de următoarea formulă:         500 x â x V(2)    w = –––––- x 1.000 [UI/kg],          V(1) x mîn care:â = concentraţia de vitamina A din soluţia de probă (pct. 5.4) la UI/ml;V(1) = volumul soluţiei de probă (pct. 5.4), în ml;V(2) = volumul cantităţii alicote luate conform pct. 5.4, în ml;m = masa de probă luată în lucru, în g.7. Observaţii7.1. Pentru probe cu concentraţie redusă de vitamina A poate fi util să se combine extractele de eter de petrol din două încărcături de saponificare (cantitate cântărită = 25 g) într-o soluţie de probă pentru determinare HPLC.7.2. Cantitatea probei utilizate pentru analiză nu ar trebui să conţină mai mult de 2 g grăsime.7.3. Dacă separarea fazică nu are loc, adăugaţi aproximativ 10 ml etanol (pct. 3.1) pentru a întrerupe emulsia.7.4. Pentru ulei din ficat de cod şi alte grăsimi pure timpul de saponificare trebuie să fie extins la 45-60 de minute.7.5. Poate fi folosită hidrochinonă în loc de BHT.7.6. Folosindu-se o coloană fazică normală, este posibilă separarea de izomeri de retinol.7.7. Se pot folosi aproximativ 150 mg de acid ascorbic în loc de soluţie de ascorbat de sodiu.7.8. Se pot folosi aproximativ 50 mg EDTA în loc de soluţia de sulfit de sodiu.8. RepetabilitateDiferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele, efectuate pe aceeaşi probă, nu trebuie să depăşească 15%, valoare relativă faţă de cel mai mare rezultat.9. Rezultate ale unui studiu de colaborare*)––Notă …
*) = Realizat de grupul de lucru pentru furaje din Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs-und Forschungsanstalten (VDLUFA)

L: numar de laboratoaren: număr de valori singulareS(r): deviaţia standard a repetabilităţiis(R): deviaţia standard a reproductibilităţiir: repetabilitateR: reproductibilitateCV(r): coeficient de variaţie al repetabilităţiiCV(R): coeficient de variaţie al reproductibilităţiiFig. 1. Aparatul de extracţie (4.8.)NOTĂ(CTCE)Fig. 1. Aparatul de extracţie (4.8.), se găseşte în Monitorul Oficial al României, Partea I, Nr. 147 din 28.02.2007, la pagina 6 (a se vedea imaginea asociată). + 
Partea B: Determinarea vitaminei E (tocoferol)1. Scop şi domeniuAceastă metodă se foloseşte pentru determinarea vitaminei E din furaje şi premixuri. Conţinutul de vitamina E este exprimat ca mg de DL acetat de tocoferol/kg. Astfel, 1 mg DL acetat de tocoferol corespunde la 0,91 mg DL tocoferol (vitamina E).Limita de determinare este de 2 mg vitamina E/kg.2. PrincipiuProba este hidrolizată cu soluţie de hidroxid de potasiu etanolic, iar vitamina E este extrasă în eter de petrol. Solventul este înlăturat prin evaporare, iar reziduul este dizolvat în metanol şi, dacă este necesar, diluat până la concentraţia necesară. Conţinutul de vitamina E este determinat prin lichid cromatografie de înaltă performanţă cu fază inversată (RP-HPLC), folosindu-se un detector cu fluorescentă sau UV.3. Reactivi3.1. Etanol, c = 96%3.2. Eter de petrol, fracţia 40°C – 60°C3.3. Metanol3.4. Soluţie de hidroxid de potasiu, â = 50 g/100 ml3.5. Soluţie de ascorbat de sodiu, â = 10 g/100 ml (a se vedea observaţiile de la pct. 7.7)3.6. Sulfit de sodiu, Na(2)S x H(2)O (x = 7-9)3.6.1. Soluţie de sulfit de sodiu, c = 0,5 mol/l în glicerol, â = 120 g/l (pentru x = 9) (a se vedea observaţiile de la pct. 7.8)3.7. Soluţie de fenolftaleină, â = 2 g/100 ml în etanol (pct. 3.1)3.8. Faza mobilă pentru HPLC: amestec de metanol (pct. 3.3) şi apă, de exemplu: 980 + 20 (v + v). Raportul exact trebuie să fie determinat prin intermediul caracteristicilor coloanei folosite.3.9. Azot liber de oxigen3.10. DL-α-tocoferol acetat, extrapur, cu activitate certificată3.10.1. Soluţie stoc din DL-α-acetat de tocoferol: se cântăresc, cu aproximaţie de 0,1 mg, 100 mg DL-α-acetat de tocoferol (pct. 3.10) într-un balon cotat de 100 ml. Se dizolvă în etanol (pct. 3.1) şi se completează până la semn cu acelaşi solvent. Astfel, 1 ml din această soluţie conţine 1 mg DL-a-acetat de tocoferol (pentru control UV, a se vedea pct. 5.6.2.3; pentru stabilizare, a se vedea observaţiile de la pct. 7.4)3.11. DL-α-tocoferol, extrapur, cu activitate certificată3.11.1. Se cântăresc, cu aproximaţie de 0,1 mg, 100 mg de DL-α-tocoferol (pct. 3.10) într-un balon gradat de 100 ml. Se dizolvă în etanol (pct. 3.1) şi se completează până la semn cu acelaşi solvent. Astfel, 1 ml din această soluţie conţine 1 mg DL-α-tocoferol (pentru control UV, a se vedea pct. 5.6.2.3; pentru stabilizare, a se vedea observaţiile de la pct. 7.4).3.12. 2,6 di'adterţ-butil-metilfenol (BHT) (a se vedea observaţiile de la pct. 7.5).4. Aparatură:4.1. Evaporator rotativ cu vacuum4.2. Sticlărie brună4.2.1. Baloane cu fund plat sau conice de 500 ml, cu slif4.2.2. Baloane cotate, cu dopuri rodate, cu gât strâmt, cu capacitate de 10, 25, 100 şi 500 ml4.2.3. Pâlnii de separare conice, de 1.000 ml, cu dopuri de sticlă4.2.4. Baloane piriforme din sticlă de 250 ml cu gât rodat4.3. Condensator Allihn, de 300 mm, cu legătură din sticlă, cu adaptator pentru o pipă de aprovizionare cu gaz4.4. Hârtie de filtru pentru separare fazică, cu diametrul de 185 mm (de exemplu Schieicher amp; Schuell 597 HY 1/2 sau similar).4.5. Echipament HPLC cu sistem de injecţie4.5.1. Coloana de lichid cromatografie, 250 mm x 4 mm, C(18), de 5 ori 10 æm sau echivalent4.5.2. Detector UV sau de fluorescentă, cu ajustare variabilă a lungimii de undă4.6. Spectrofotometru cu cuve de cuarţ de 10 mm4.7. Baie de apă cu agitator magnetic4.8. Aparat de extracţie constând în:4.8.1. Cilindru de sticlă, de capacitate de 1 l, căruia i se pun un gât şi dop de sticlă4.8.2. Mufă din sticlă mată, echipată cu un braţ exterior şi cu un tub ajustabil ce trece prin centru. Tubul ajustabil trebuie să aibă un capăt în formă de U situat în partea de jos şi un capăt efilat la partea opusă, astfel încât stratul superior de lichid din cilindru să poată fi transferat într-o pâlnie de separare.5. ProcedurăNOTĂ:Vitamina E este sensibilă la lumină (UV) şi oxidare. Toate operaţiunile trebuie efectuate în absenţa luminii (folosindu-se sticlărie brună sau sticlărie protejată cu folie de aluminiu) şi a oxigenului (a se spăla cu azot). În timpul extracţiei, aerul de deasupra lichidului trebuie înlocuit de azot (a se evita presiunea prin lărgirea dopului din când în când).5.1. Pregătirea probei: se mărunţeşte proba astfel încât să treacă printr-o sită cu ochiuri de 1 mm, avându-se grijă să se evite generarea de căldură. Mărunţirea trebuie efectuată imediat înainte de cântărire şi saponificare, altfel pot avea loc pierderi de vitamina E.5.2. Saponificare: în funcţie de conţinutul de vitamina E, se cântăresc, cu aproximaţie de 0,01 g, 2 până la 25 g din probă într-un balon de 500 ml cu fundul plat sau conic (pct. 4.2.1). Se adaugă în continuare, prin amestecare, 130 ml etanol (pct. 3.1), aproximativ 100 mg BHT (pct. 3.12), 2 ml soluţie de ascorbat de sodiu (pct. 3.5) şi 2 ml soluţie de sulfit de sodiu (pct. 3.6). Se potriveşte un condensator (pct. 4.3) la balon şi se scufundă balonul într-o baie de apă cu agitator mecanic (pct. 4.7). Se încălzesc până la fierbere şi se lasă la reflux timp de 5 minute. Se adaugă apoi 25 ml soluţie de hidroxid de potasiu (pct. 3.4) prin condensator (pct. 4.3) şi se lasă la reflux timp de 25 de minute, agitându-se sub un flux uşor de azot. Apoi se clăteşte condensatorul cu aproximativ 20 ml apă şi se răceşte conţinutul balonului la temperatura camerei.5.3. Extracţie: se transferă, prin decantare, întreaga soluţie de saponificare, prin clătire cu un volum total de 250 ml apă, într~o pâlnie de separare de 1.000 ml, (pct.4.2.3) sau în aparatul de extracţie (pct. 4.8). Se clăteşte balonul de saponificare, în continuare, cu 25 ml etanol (pct. 3.1) şi 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) şi se transferă soluţiile de clătire în tubul de separare sau în aparatul de extracţie. Proporţia de apă şi etanol în soluţiile combinate trebuie să fie 2:1. Se scutură viguros timp de două minute şi se lasă să se sedimenteze timp de două minute.5.3.1. Extracţie folosind o pâlnie de separare (pct. 4.2.3); când straturile de lichid s-au separat (a se vedea pct. 7.3), se transferă stratul de eter de petrol într-o altă pâlnie de separare (pct. 4.2.3). Se repetă această extracţie de două ori cu 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) şi de două ori cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2). Se spală extractele combinate din pâlnia de separare de două ori, prin amestecare uşoară (pentru a se evita formarea emulsiilor), cu cantităţi de 100 ml apă şi după agitare repetată alte cantităţi de 100 ml apă, până când apa rămâne incoloră la adăugarea soluţiei de fenolftaleină (pct. 3.7) (spălarea de 4 ori este de obicei suficientă). Se filtrează extractul spălat printr~un filtru împăturit, pentru separare fazică (pct. 4.4), pentru a se înlătura orice cantitate de apă în suspensie, într-un balon cotat de 500 ml (pct. 4.2.2). Se spală pâlnia de separare şi filtrul cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2), se umple până la semn cu eter de petrol (pct. 3.2) şi se amestecă bine.5.3.2. Extracţie folosind un aparat de extracţie (pct. 4.8); când straturile s-au separat (a se vedea observaţia de la pct. 7.3) se înlocuieşte dopul cilindrului de sticlă (pct. 4.8.1) cu inserţie din sticlă mată (pct. 4.8.2) şi se aranjează capătul de jos în formă de U al tubului ajustabil, astfel încât să se afle deasupra nivelului interfeţei. Prin aplicarea unei presiuni de la generatorul nitrogenului, prin braţul exterior, se transferă stratul superior de eter de petrol într-un tub de separare de 1.000 ml (pct. 4.2.3). Se adaugă 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) în cilindrul de sticlă, se ataşează dopul şi se agită bine. Se lasă straturile să se separe şi se transferă stratul de deasupra în tubul de separare ca şi mai înainte. Se repetă procedura extracţiei cu încă 100 ml eter de petrol (pct. 3.2), apoi de două ori cu cantităţi de 50 ml eter de petrol (pct. 3.2) şi se adaugă straturile de eter de petrol în tubul de separare. Se spală extractele combinate din eter de petrol, după cum este descris la pct. 5.3.1, şi se procedează după cum este descris acolo.5.4. Prepararea soluţiei probă pentru HPLC: se pipetează o cantitate alicotă din soluţia de eter de petrol (de la pct. 5.3.1 la pct. 5.3.2) într-un balon în formă de pară, de 250 ml (pct. 4.2.4). Se evaporă solventul aproape de uscare pe evaporatorul rotativ (pct. 4.1) cu presiune redusă, la o temperatură a băii ce nu depăşeşte 40°C. Se readuce la presiunea atmosferică prin admisie de azot (pct. 3.9) şi se îndepărtează balonul de pe evaporatorul rotativ. Se înlătură solventul rămas printr-un curent de azot (pct. 3.9) şi se dizolvă imediat reziduul cu un volum cunoscut (10-100 ml) de metanol (pct. 3.3) (concentraţia de L-α-tocoferol trebuie să fie între 5 æ/ml şi 30 æg/ml).5.5. Determinare prin HPLC: vitamina E este separată pe o coloană cu fază inversată de C(18) (pct. 4.5.1), iar concentraţia este măsurată printr-un detector de fluorescentă (excitaţie: 295 nm, emisie: 330 nm) sau un detector de UV (292 nm) (pct. 4.5.2). Se injectează o fracţie alicotă (de exemplu: 20 æl) de soluţie metanolică obţinută conform pct. 5.4 şi se realizează o eluţie cu faza mobilă (pct. 3.8). Se calculează media înălţimii peak-ului mai multor injecţii din aceeaşi soluţie de probă şi mediile înălţimii peak-ului ale mai multor injecţii ale soluţiilor de calibrare (pct. 5.6.2).Condiţii HPLC: Sunt oferite următoarele condiţii pentru orientare; pot fi folosite alte situaţii, cu condiţia ca acestea să ofere rezultate echivalente.Coloană de lichid cromatografic (pct. 4.5.1): 250 mm x 4 mm, C(18), ambalaje de 5 æm sau 10 æm sau echivalentFaza mobilă (pct. 3.8): amestec de metanol (pct. 3.3) şi apă, de exemplu: 980 + 20 (v + v)Debit: 1-2 ml/minDetector (pct. 4.5.2): detector cu fluorescentă(excitaţie: 295 nm, emisie: 330 nm) sau detector de UV (292 nm)5.6. Calibrare (DL acetat de tocoferol sau DL-α-tocoferol)5.6.1. DL acetat de tocoferol standard de referinţă5.6.1.1. Prepararea soluţiei standard de lucruSe transferă cu o pipetă 25 ml soluţie de DL acetat de tocoferol (pct. 3.10.1) într-un balon de 500 ml cu fund plat sau conic (pct. 4.2.1) şi se hidrolizează după cum este descris la pct. 5.2. Apoi se extrage cu eter de petrol (pct. 3.2), în concordanţă cu pct. 5.3, şi se completează până la 500 ml cu eter de petrol (pct. 3.2). Se evaporă 25 ml din acest extract pe evaporatorul rotativ (a se vedea pct. 5.4) până aproape de uscare, se înlătură solventul rămas cu un curent de azot (pct. 3.9) şi se redizolvă reziduurile în 25,0 ml metanol (pct. 3.3). Concentraţia nominală a acestei soluţii este 45,5 æg DL-α-tocoferol/ml, echivalent cu 50 æg DL-α-tocoferol acetat/ml. Soluţia standard de lucru trebuie preparată proaspătă, înainte de folosire.5.6.1.2. Prepararea soluţiilor de calibrare sau a curbei de calibrare: se transferă 1,0, 2,0, 4,0 şi 10,0 ml din soluţia standard de lucru într-o serie de baloane gradate de 20 ml, se completează până la semn cu metanol (pct. 3.3) şi se amestecă. Concentraţiile nominale ale acestor soluţii sunt: 2,5; 5,0; 10,0 şi 25,0 æg/ml DL-α-tocoferol acetat, de exemplu: 2,28, 4.55, 9,10 æg/ml şi 22,8 æg/ml DL-α-tocoferol. Se injectează 20 æl din fiecare soluţie de calibrare, de mai multe ori, şi se determină media înălţimii peak-ului. Folosindu-se media înălţimilor peak-ului, se întocmeşte un grafic de calibrare.5.6.1.3. Standardizarea UV a soluţiei de tocoferol acetat (pct. 3.10.1)Se dizolvă 5,0 ml soluţie de tocoferol acetat (pct. 3.10.1) până la 25,0 ml cu etanol şi se măsoară spectrul UV al soluţiei faţă de etanol (pct. 3.1) cu un spectrofotometru (pct. 4.6) la o lungime de undă între 250 nm şi 320 nm.Absorbţia maximă trebuie să fie la 284 nm:E(tcm)^1% = 43,6 la 284 nm în etanolLa această dilutie trebuie obţinută o valoare de extincţie de 0,84 – 0,88.5.6.2. DL-α-tocoferol standard de referinţă5.6.2.1. Prepararea soluţiei standard de lucruSe transferă cu pipeta 2,0 ml soluţie de tocoferol acetat (pct. 3.11.1) într-un balon cotat de 50 ml, se dizolvă în metanol (pct. 3.3) şi se completează până la semn cu metanol. Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 40 æg DL-α-tocoferol/ml, echivalent cu 44,0 æg de tocoferol acetat/ml. Soluţia standard de lucru trebuie preparată proaspătă înainte de folosire.5.6.2.2. Prepararea soluţiilor de calibrare şi a graficului de calibrareSe transferă 1,0; 2,0; 4,0 şi 10,0 ml din soluţia standard de lucru diluată într-o serie de baloane cotate de 20 ml, se completează până la semn cu metanol (pct. 3.3) şi se amestecă. Concentraţiile nominale ale acestor soluţii sunt: 2,0; 4,0; 8,0 şi 20,0 æg/ml şi 22,0 æg/ml tocoferol acetat. Se injectează 20 æl din fiecare soluţie de calibrare de mai multe ori şi se determină mediile înălţimii peak-ului. Folosindu-se mediile înălţimii peak-ului, se întocmeşte un grafic de calibrare.5.6.2.3. Standardizarea UV a soluţiei DL-α-tocoferol (pct. 3.11.1)Se dizolvă 2,0 ml până la 25,0 ml din soluţia stoc de tocoferol (pct. 3.11.1) cu etanol (pct. 3.1) şi se măsoară spectrul UV al acestei soluţii faţă de etanol cu spectrofotometru (pct. 4.6) la lungime de undă între 250 nm şi 320 nm.Absorbţia maximă trebuie să fie la 292 nm:E(tcm)^1% = 75,8 la 292 nm în etanol.La această diluţie trebuie obţinută o valoare de extincţie de 0,6.6. Calcularea rezultatelorPornindu-se de la media înălţimii peak-ului pentru vitamina E a soluţiei de probă, se determină concentraţia soluţiei de probă în æg/ml (calculată ca α-tocoferol acetat) faţă de curba de calibrară (pct. 5.6.1.2 sau 5.6.2.2).Conţinutul w de vitamina E în mg/kg de probă este dat de următoarea formulă:w = 500 X â X V(2) [mg/kg]/V(1) x m,în care:â = concentraţia de vitamina E din soluţia de probă (pct. 5.4) în UI/ml;V(1) = volumul soluţiei de probă (pct. 5.4), în æg/ml;V(2) = volumul cantităţii alicote folosite la pct. 5.4, în ml;m = masa porţiunii de testat, în g.7. Observaţii7.1. Pentru probe cu concentraţie redusă de vitamina E poate fi util să se combine extractele de eter de petrol din două încărcături de saponificare (cantitate cântărită: 25 g) într-o soluţie de probă, pentru determinare HPLC.7.2. Masa probei utilizate pentru analiză nu ar trebui să conţină mai mult de 2 g grăsime.7.3. Dacă separarea fazică nu are loc, se adaugă aproximativ 10 ml l etanol (pct. 3.1), pentru a întrerupe emulsia.7.4. După măsurarea cu spectrofotometrul a soluţiei de tocoferol acetat sau DL-α-tocoferol, în conformitate cu pct. 5.6.1.3 sau 5.6.2.3, se adaugă aproximativ 10 mg BHT (pct. 3.12) la soluţie (3.10.1 sau 3.10.2) şi se păstrează soluţia la frigider (perioadă de păstrare de maximum 4 săptămâni).7.5. Poate fi folosită hidrochinona în loc de BHT.7.6. Folosindu-se o coloană fazică normală, este posibilă separarea unui a-, â-, Y şi tocoferol.7.7. Se pot folosi aproximativ 150 mg acid ascorbic în loc de soluţie de ascorbat de sodiu.7.8. Se pot folosi aproximativ 50 mg EDTA în loc de soluţie de sulfit de sodiu.8. RepetabilitateDiferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele, efectuate pe aceeaşi probă, nu trebuie să depăşească 15%, valoare relativă faţă de cel mai mare rezultat.9. Rezultatele unui studiu de colaborare*)––Notă …
*) = Realizat de grupul de lucru pentru furaje din Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs-und Forschungsanstalten (VDLUFA)

L: numar de laboratoaren: număr de valori singulareS(r): deviaţia standard a repetabilităţiis(R): deviaţia standard a reproductibilităţiir: repetabilitateR: reproductibilitateCV(r): coeficient de variaţie al repetabilităţiiCV(R): coeficient de variaţie al reproductibilităţiiFig. 1. Aparatul de extracţie (4.8.)NOTĂ(CTCE)Fig. 1. Aparatul de extracţie (4.8.), se găseşte în Monitorul Oficial al României, Partea I, Nr. 147 din 28.02.2007, la pagina 10 (a se vedea imaginea asociată). + 
Partea C: Determinarea triptofanului1. Scop şi domeniuAceastă metodă se foloseşte pentru determinarea cantităţii totale şi libere de triptofan din furaje. Nu se face distincţie între formele D şi L.2. PrincipiuPentru determinarea triptofanului total, proba este hidrolizată în condiţii alcaline cu soluţie saturată de hidroxid de bariu şi încălzită la 110°C, pentru 20 de ore. După hidroliză se adaugă standardul intern. Pentru determinarea triptofanului liber proba este extrasă în condiţii de aciditate uşoară, în prezenţa standardului intern. Triptofanul şi standardul intern din hidrolizat sau din extract sunt determinate prin HPLC cu detector cu fluorescentă.3. Reactivi3.1. Trebuie folosită apă bidistilată sau apă de calitate echivalentă (conductivitate <10 æs cm)3.2. Substanţa standard: triptofan (puritate/conţinut > 99%), uscată sub vacuum pe pentoxid de fosfor3.3. Substanţă standard intern: a-metil-triptofan (puritate/conţinut > 99%), uscată sub vacuum pe pentoxid de fosfor3.4. Hidroxid de bariu octahidrat [trebuie avut grijă pentru a nu se expune Ba(OH)(2) x 8H(2)O excesiv la aer, pentru a se evita formarea de BaCO(3) ce ar putea afecta determinarea] (a se vedea observaţia de la pct. 9.3)3.5. Hidroxid de sodiu3.6. Acid ortofosforic, w = 85%3.7. Acid clorhidric, 20 = 1,19 g/ml3.8. Metanol, grade HPLC3.9. Eter de petrol, domeniu de fierbere 40-60°C3.10. Soluţie de hidroxid de sodiu, c = 1 mol/lSe dizolvă 40,0 g NaOH (pct. 3.5) în apă şi se completează cu apă până la 1 l (pct. 3.1)3.11. Acid clorhidric, c = 6 mol/l. Se iau 492 ml HCL (pct. 3.7) şi se completează cu apă până la 1 l.3.12. Acid clorhidric, c = 1 mol/l. Se iau 82 ml HCL (pct. 3.7) şi se completează cu apă până la 1 l.3.13. Acid clorhidric, c = 0,1 mol/l. Se iau 8,2 ml HCL (pct. 3.7) şi se completează cu apă până la 1 l.3.14. Acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l. Se iau 34 ml acid ortofosforic (pct. 3.6) şi se completează cu apă până la 1 l (pct. 3.1).3.15. Soluţie concentrată de triptofan (pct. 3.2), c = 2,50 mol/ml: într-un balon cotat de 500 ml se dizolvă 0,2553 g triptofan (pct. 3.2) în acid clorhidric (pct. 3.13) şi se completează până la semn cu acid clorhidric (pct. 3.13). Se depozitează la -18°C pentru maximum 4 săptămâni.3.16. Soluţie concentrată standard intern, c = 2,50 æmol/ml.Într-un balon cotat de 500 ml se dizolvă 0,2728 g a-metil-triptofan (pct. 3.3) în acid clorhidric (pct. 3.13) şi se completează până la semn cu acid clorhidric (pct. 3.13). Se depozitează la -18°C pentru maximum 4 săptămâni.3.17. Soluţie de triptofan standard de calibrare şi standard intern: se iau 2,00 ml soluţie concentrată de triptofan (pct. 3.15) şi 2,00 ml soluţie standard intern concentrat (a-metil-triptofan) (pct. 3.16). Se diluează cu apă (pct. 3.1) şi metanol (pct. 3.8) cu aproximativ acelaşi volum şi până la aproximativ aceeaşi concentraţie de metanol (10-30%) ca şi hidrolizatul final finisat. Soluţia standard trebuie să fie proaspăt preparată înainte de folosire.3.18. Acid acetic3.19. 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol3.20. Etanolamină > 98%3.21. Soluţie de 1 g – 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (pct. 3.19) în 100 ml metanol 1% (pct. 3.8)3.22. Fază mobilă pentru HPLC: 3,00 g acid acetic (pct. 3.18) + 900 ml apă (pct. 3.1) + 50,0 ml soluţie (pct. 3.21) de 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (pct. 3.19) în metanol (pct. 3.8) (1 g/100 ml). Se ajustează pH-ul la 5,00, folosindu-se etanolamină (pct. 3.20). Se completează până la 1.000 ml cu apă (pct. 3.1).4. Aparatură4.1. Echipament HPLC cu un detector spectrofluorimetric4.2. Coloană de lichid cromatografie, 125 mm x 4 mm, C(18), în ambalaje de 3 æm sau echivalent4.3. pH-metru4.4. Balon de polipropilenă, capacitate 125 ml, cu gât larg şi dop cu şurub4.5. Membrană filtrantă, 0,45 æm4.6. Autoclav sau etuvă cu vid 110(±2)°C,1,4(±0,1) bar.4.7. Agitator mecanic sau agitator magnetic4.8. Agitator vortex5. Procedură5.1. Prepararea probelorProba trebuie să treacă printr-o sită de 0,5 mm. Probele cu umiditate ridicată trebuie să fie uscate în aer, la o temperatură ce nu depăşeşte 50°C, sau uscate cu gheaţă, înainte de mărunţire. Probele cu conţinut ridicat de grăsimi trebuie extrase cu eter de petrol (pct. 3.9) înainte de mărunţire.5.2. Determinarea triptofanului liber (extract)Se cântăreşte, cu aproximaţie de 1 mg, o cantitate de probă (1-5 g) (pct. 5.1) într-un balon conic. Se adaugă 100,0 ml acid clorhidric, c = 0,1 mol/l (pct. 3.13) şi 5,00 ml din soluţie standard internă concentrată (pct. 3.16). Se agită sau se amestecă timp de 60 de minute, folosindu-se un agitator mecanic sau un agitator magnetic (pct. 4.7). Se permite sedimentului să se depună şi se pipetează 10,0 ml din soluţia de supernatant într-un pahar de laborator. Se adaugă 5 ml acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l. Se ajustează pH-ul la 3,0 folosind hidroxid de sodiu, c = 1,0 mol/l. Se adaugă suficient metanol (pct. 3.8) pentru a se realiza o concentraţie între 10 şi 30% de metanol volum final. Se transferă într-un balon cotat de volum corespunzător şi se diluează cu apă până la un volum necesar pentru cromatografie [aproximativ acelaşi volum ca şi soluţia de calibrare standard (pct. 3.17)].Se filtrează câţiva ml de soluţie printr-un filtru de membrană de 0,45 æm (pct. 4.5), înaintea injectării pe coloana HPLC. Se trece la etapa cromatografiei, în conformitate cu pct. 5.4. Se protejează soluţia standard şi extrasele faţă de lumina directă a soarelui. Dacă nu este posibil să se analizeze extractele în aceeaşi zi, acestea pot fi păstrate la 5°C pentru maximum 3 zile.5.3. Determinarea triptofanului total (hidrolizat)Se cântăreşte cu aproximaţie 0,2 mg, de la 0,1 la 1 g din proba preparată (pct. 5.1), în balonul de propilenă (pct. 4.4). Cantitatea de probă cântărită trebuie să aibă un conţinut de azot de 10 mg. Se adaugă 8,4 g de octahidrat de hidroxid de bariu (pct. 3.4) şi 10 ml de apă. Se amestecă cu un agitator vortex (pct. 4.8) sau cu un agitator magnetic (pct. 4.7). Se lasă magnetul acoperit cu teflon, în amestec. Se spală pereţii vasului cu 4 ml de apă. Se pune dopul cu şurub şi se închide uşor balonul. Se transferă într-o autoclavă (pct. 4.6) cu apă ce fierbe şi se lasă la aburi pentru 30-60 de minute). Se închide autoclava şi se realizează autoclavare la 110(^+2)°C pentru 20 de ore. Înaintea deschiderii autoclavei se reduce temperatura până la 100°C. Pentru a evita cristalizarea Ba(OH)(2) x 8H(2)O, se adaugă la amestecul cald 30 ml de apă la temperatura camerei. Se scutură sau se agită uşor. Se adaugă 2,00 ml soluţie standard intern concentrată (de a-metil-triptofan) (pct. 3.16). Se răcesc paharele pe baie de apă timp de 15 minute. Se adaugă apoi 5 ml de acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l (pct. 3.14). Se păstrează vasul la baia de răcire şi se neutralizează cu HCl, c = 6 mol/l (pct. 3.11) în timp ce se agită şi se ajustează pH-ul la 3,0 folosindu-se HCl, c = 1 mol/l (pct. 3.12). Se adaugă suficient metanol pentru a se realiza o concentraţie între 10 şi 30% de metanol în volumul final. Se transferă într-un balon cotat de volum corespunzător şi se diluează cu apă până la semn, necesar pentru cromatografie (de exemplu 100 ml). Adăugarea de metanol nu trebuie să ducă la apariţia precipitatului.Se filtrează câţiva ml din soluţie printr-un filtru de membrană de 0,45 æm (pct. 4.5) înaintea injectării pe coloana HPLC, se trece la etapa cromatografiei, în conformitate cu pct. 5.4. Se protejează soluţia standard şi hidrolizatele faţă de lumina directă a soarelui. Dacă nu este posibil să se analizeze hidrolizatele în aceeaşi zi, acestea pot fi depozitate la 5°C, pentru maximum 3 zile.5.4. Determinare prin HPLCSunt oferite pentru instruire următoarele condiţii de eluţie isocratică; pot fi folosite alte situaţii, cu condiţia ca acestea să ofere rezultate echivalente (a se vedea, de asemenea, observaţiile de la pct. 9.1 şi 9.2).Coloana de lichid cromatografie (pct. 4.2): 125 mm x 4 mm, C(18), ambalaj de 3 æm.Temperatura coloanei: temperatura camerei.Faza mobilă (pct. 3.22): 3,00 g acid acetic apă (pct. 3.1) + 50,0 ml soluţie (pct. 3.21) de 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (pct. 3.19) în metanol (pct. 3.8) (1 g/100 ml).Se ajustează pH-ul la 5,00, folosindu-se etanolamină (pct. 3.20).Se completează până la 1.000 ml cu apă [pct. 3.1; de exemplu: 980+20 (v + v)].Debitul: 1 ml/min.Timpul total de funcţionare: aproximativ 34 minute.Detecţia la lungimea de undă: excitaţie: 280 nm, emisie: 356 nm.Volumul de injecţie: 20 æl6. Calcularea rezultatelor    A x B x C x D x E x MW    –––––––- = g triptofan/ 100 g probă, unde:    F x G x H x 10000 x WA = zona peak-ului pentru standardul intern, soluţie standard de calibrare ( pct. 3.17);B = zona peak-ului triptofanului, extract (pct. 5.2) sau hidrolizat (pct. 3.3);C = volumul, în ml (2 ml), al soluţiei de triptofan concentrat (pct. 3.15) adăugat soluţiei de calibrare (pct. 3.17);D = concentraţia, în/æmol/ml (= 2,50), din soluţia de triptofan concentrat (pct. 3.15) adăugată soluţiei de calibrare (pct. 3.17);E = volumul, în ml, al soluţiei concentrate standard intern (pct. 3.16), adăugată la extract (pct. 5.2) (= 5,00 ml) sau hidrolizat (pct. 5.3) (= 2,00 ml);F = zona peak-ului pentru standardul intern, extract (pct. 5.2) sau hidrolizat (pct. 5.3);G = zona peak-ului triptofanului, soluţie standard de calibrare (pct. 3.17);H = volumul în ml (= 2,00) al soluţiei standard intern concentrată (pct. 3.16), adăugată la soluţia standard de calibrare (pct. 3.17);W = greutatea probei în g (corectată la greutatea originală, dacă este uscată şi/sau degresată);MW = greutatea moleculară a triptofanului (= 204,23).7. RepetabilitateDiferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele, efectuate pe aceeaşi probă, nu trebuie să depăşească 10% valoare relativă faţă de cel mai mare rezultat.8. Rezultate ale unui studiu de colaborareA fost realizat un studiu de colaborare la nivelul comunitar (a patra intercomparaţie) în cadrul căruia s-au analizat 3 probe, de către 12 laboratoare, pentru a certifica metoda pentru hidroliză. Au fost efectuate 5 replicate din fiecare probă. Rezultatele sunt oferite de tabelul următor:

L: numar de laboratoaren: număr de valori singulareS(r): deviaţia standard a repetabilităţiiS(R): deviaţia standard a reproductibilităţiir: repetabilitateR: reproductibilitateCV(r): coeficient de variaţie al repetabilităţiiCV(R): coeficient de variaţie al reproductibilităţiiA fost realizat un alt studiu de colaborare la nivelul comunitar (a treia intercomparaţie) în cadrul căruia s-au analizat două probe de către 13 laboratoare, pentru a se certifica metoda de extracţie pentru triptofanul liber. Au fost efectuate analize replicate (5) din fiecare probă. Rezultatele sunt oferite de tabelul următor:

L: numar de laboratoaren: număr de valori singulareS(r): deviaţia standard a repetabilităţiiS(R): deviaţia standard a reproductibilităţiir: repetabilitateR: reproductibilitateCV(r): coeficient de variaţie al repetabilităţiiCV(R): coeficient de variaţie al reproductibilităţiiA fost realizat un alt studiu de colaborare la nivel comunitar, în cadrul căruia s-au analizat 4 probe de către 7 laboratoare, cu scopul unei certificări a triptofanului prin hidroliză. Rezultatele sunt oferite mai jos. Analize replicate (5) au fost efectuate pe fiecare probă.

L: numar de laboratoaren: număr de valori singulareS(r): deviaţia standard a repetabilităţiiS(R): deviaţia standard a reproductibilităţiir: repetabilitateR: reproductibilitateCV(r): coeficient de variaţie al repetabilităţiiCV(R): coeficient de variaţie al reproductibilităţii9. Observaţii9.1. Folosirea unor condiţii cromatografice speciale poate crea o mai bună separare între tiptofan şi a-metil-triptofan.Eluţie isocratică urmată de spălarea gradientului de coloană lichid cromatografie cu: 125 mm x 4 mm, C(18), ambalaje de 5 æm sau echivalent.Temperatura coloanei: 32°C    Faza mobilă: A: 0,01 mol/KH(2)PO(4)/metanol, 95 + 5 (V + V) 1                        B: Metanol    Program gradient: 0 min. ……. 100% A 0% B                        15 min. ……. 100% A 0% B                        17 min. ……. 60% A 40% B                        19 min. ……. 60% A 40% B                        21 min. ……. 100% A 0% B                        33 min. ……. 100% A 0% BDebit: 1,2 ml/min.Timpul total de separare: aproximativ 33 de minute9.2. Cromatografia variază în concordanţă cu tipul de HPLC şi de materialul de împachetare a coloanei folosit.Sistemul ales trebuie să fie capabil să ofere o separare de bază între tiptofan şi standardul intern. Mai mult, este important ca produsele de degradare să fie bine separate de triptofan şi de standardul intern. Hidrolizatele fără standard intern trebuie testate pentru a se verifica linia de bază pentru impurităţi sub standardul intern. Este important ca timpul de achiziţie să fie suficient de lung pentru eluţia tuturor produselor de degradare, altfel pot interfera limite cu eluţie târzie cu utilizări cromatografice ulterioare. În domeniul funcţionării sistemul de cromatografie trebuie să ofere răspuns linear. Răspunsul linear trebuie măsurat cu o concentraţie constantă (normală) a standardului intern şi a concentraţiilor variate de triptofan. Este important şi faptul că mărimea atât a peak-urilor triptofanului, cât şi a peak-urilor standardelor interne este cuprinsă în domeniul linear al sistemului HPLC/fluorescenţă. Dacă peak-ul triptofanului şi/sau al standardului intern este prea mic sau ridicat, analiza trebuie repetată cu o altă cantitate de probă şi/sau cu un volum final schimbat.9.3. Hidroxid de bariuCu timpul hidroxidul de bariu devine mai dificil de dizolvat.Aceasta duce la o soluţie neclară pentru determinarea HPLC ce poate produce rezultate scăzute pentru triptofan.–––

	Redacția Lex24 Drept la Sursa!
	Articole Urmărește