ce stabileşte metode de analiza pentru controlul oficial al furajelor privind nivelurile amidonului, proteinei brute, proteinei brute care poate fi dizolvată de pepsina şi acid clorhidric, gosipolului liber şi total şi cu referire la activitatea pepsinei, precum şi determinarea nivelurilor de tilozina şi virginiamicina din furaje
+
Articolul 1Analizele pentru controalele oficiale ale furajelor, în ceea ce priveşte nivelurile acestora de amidon, proteina bruta, proteina bruta ce poate fi descompusa de pepsina şi acid clorhidric, de gosipol liber sau total şi în ceea ce priveşte activitatea pepsinei, se efectuează utilizându-se metodele descrise în anexa nr. 1. +
Articolul 2Analizele pentru controalele oficiale ale furajelor, în ceea ce priveşte determinarea nivelurilor de tilozina şi virginiamicina din furaje, se efectuează utilizându-se metodele descrise în anexa nr. 2. +
Articolul 3Autoritatea Naţionala Sanitară Veterinara şi pentru Siguranţa Alimentelor informează Comisia Europeană cu privire la actele normative şi prevederile administrative necesare pentru implementarea prezentei norme sanitare veterinare. +
Articolul 4Anexele nr. 1 şi 2 fac parte integrantă din prezenta norma sanitară veterinara. +
Anexa 1la norma sanitară veterinaraI. DETERMINAREA AMIDONULUIMetoda polarimetrica1. Scop şi domeniu de aplicareAceasta metoda se utilizează pentru determinarea nivelurilor de amidon şi a produselor de degradare a amidonului cu greutate moleculara mare din furaje, în scopul verificării conformitatii cu Norma veterinara ce stabileşte metoda de calcul pentru valoarea energetica a furajelor combinate pentru păsări, aprobată prin Ordinul preşedintelui Agenţiei Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor nr. 17/2004, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 şi 1.020 bis din 4 noiembrie 2004, ce transpune în legislaţia naţionala Directiva Comisiei 86/174/CEE , şi cu Norma sanitară veterinara privind circulaţia şi utilizarea materiilor prime furajere, aprobată prin Ordinul ministrului agriculturii, pădurilor, apelor şi mediului nr. 507/2003, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 683 şi 683 bis din 29 septembrie 2003, ce transpune în legislaţia naţionala Directiva Consiliului 96/25/CE .2. PrincipiuMetoda cuprinde doua etape. în prima etapa, proba se tratează, atunci când este fierbinte, cu acid clorhidric diluat. După clarificare şi filtrare, rotatia optica a soluţiei trebuie masurata prin polarimetrie.În a doua etapa, proba trebuie extrasa cu etanol 40%. După acidifierea filtratului cu acid clorhidric, clarificand şi filtrand soluţia, rotatia optica se măsoară ca în prima etapa.Conţinutul în amidon al probei se calculează făcându-se diferenţa dintre cele doua măsurători, multiplicata cu un factor cunoscut.3. Reactivi3.1. Acid clorhidric (w/w) 25%, d: 1,126 g/ml3.2. Acid clorhidric (w/v) 1,128%Concentraţia trebuie să fie controlată prin titrare, utilizându-se o soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 mol/litru în prezenta de roşu de metil (w/v) 0,1% în etanol 94% (V/V). 10 ml = 30,94 ml de NaOH 0,1 mol/litru3.3. Soluţie Carrez I: Se dizolva în apa 21,9 g acetat de zinc Zn[CH(3)COO](2). (2)H(2)0 şi 3g de acid acetic glacial. Se aduce la volum până la 100 ml cu apa3.4. Soluţie Carrez II: Se dizolva în apa 10,6 g de ferocianura de potasiu [K(4)(Fe(CN)(6)]. 3H(2)0. Se aduce la volum până la 100 ml cu apa3.5. Etanol 40% (v/v), d: 0,948 g/ml la 20°C.4. Aparatura4.1. Retorta Erlenmeyer de 250 ml cu ajustare de sticlă mata standard şi cu condensator de reflux4.2. Polarimetru sau sacharimetru5. Procedura5.1. Prepararea probeiSe marunteste proba până când este destul de fina pentru a trece printr-o sita cu ochiuri de 0,5 mm.5.2. Determinarea rotatiei optice totale (P sau S) (Vezi observatia 7.1)Se cantaresc 2,5 g din proba maruntita, cu o aproximatie de mg, şi se plaseaza într-o retorta gradata de 100 ml. Se adauga 25 ml de acid clorhidric (pct. 3.2), se agita pentru a se obţine chiar distribuţia probei-test şi se adauga încă 25 ml de acid clorhidric (pct. 3.2). Se imerseaza retorta în apa fiarta, agitandu-se energic şi constant timp de 3 minute, pentru a se preveni formarea de flocoane. Cantitatea de apa din baia de apa trebuie să fie suficienta pentru ca baia sa rămână la punctul de fierbere, atunci când retorta este introdusă în aceasta.Retorta nu trebuie să fie scoasa din baie cat timp se agita. După exact 15 minute, se scoate retorta din baie, se adauga 30 ml de apa rece şi se raceste imediat la 20°C.Se adauga 5 ml de soluţie Carrez I (pct. 3.3) şi se agita timp de un minut. Apoi se adauga 5 ml de soluţie Carrez II (pct. 3.4) şi se agita din nou, timp de un minut. Se aduce la volum cu apa, se omogenizeaza şi se filtreaza. Dacă filtratul nu este perfect clar (fapt ce este rar), se repeta determinarea utilizându-se o cantitate mai mare de soluţii Carrez I şi II, de exemplu 10 ml.Se măsoară rotatia optica a soluţiei într-un tub de 200 mm cu polarimetru sau cu sacharimetru.5.3. Determinarea rotatiei optice (P' sau S') a substanţelor solubile în etanol 40%Se cantaresc 5 g din proba cu o aproximatie de mg, se plaseaza într-o retorta gradata de 100 ml şi se adauga aproximativ 80 ml de etanol (pct. 3.5) (vezi observatia 7.2). Se lasă retorta sa stea timp de o ora la temperatura camerei. În acest timp, se agita puternic de 6 ori, astfel încât proba-test este bine amestecata cu etanol. Se aduce la volum cu etanol (pct. 3.5), se omogenizeaza şi se filtreaza.Se picura 50 ml din filtrat (= 2,5 g din proba) într-o retorta Erlenmeyer de 250 ml, se adauga 2,1 ml de acid clorhidric (pct. 3.1) şi se agita cu vigoare. Se echipeaza retorta Erlenmeyer cu un condensator de reflux şi se imerseaza acesta din urma într-o baie de apa fierbinte. După exact 15 minute se indeparteaza retorta Erlenmeyer din baie, se transfera conţinutul într-o retorta gradata de 100 ml, clatindu-se cu putina apa rece, şi se raceste la 20°C. Se clarifica filtratul utilizându-se soluţiile Carrez I (pct. 3.3) şi II (pct. 3.4), se aduce la volum cu apa, se omogenizeaza, se filtreaza şi se măsoară rotatia optica, asa cum s-a indicat la pct. 5.2.6. Calcularea rezultatelorConţinutul de amidon (%) este calculat după cum urmează:6.1. Măsurare cu polarimetru 2000(P – P') Conţinut de amidon (%) = ––––– , 20° [f2α] Dunde:P = rotatia optica totală în grade;P'= rotatia optica în grade a substanţelor solubile în etanol 40%'(V/V); 20° [f2α] = rotaţie optica specifică de amidon pur. Valorile numerice D acceptate convenţional pentru acest factor sunt următoarele:+ 185,9°: amidon din orez;+ 185,4°: amidon din cartofi;+ 184,6°: amidon din porumb;+ 182,7°: amidon din grâu;+ 181,5°: amidon din orz;+ 181,3°: amidon din ovaz;+ 184,0°: alte tipuri de amidon şi amestecuri de amidon din furaje combinate.6.2. Măsurarea cu zaharimetru 2000 (2N x 0,665)x(S-S') 26,6 N x (S-S') Conţinut de amidon = ––- x ––––––- – –––––-, 20° 20° [f2α] 100 [α] D Dunde:S = rotatia optica totală în grade zaharimetrice;S' = rotatia optica în grade zaharimetrice a substanţelor solubile în etanol 40% (V/V);N = greutatea în grame a sucrozei în 100 ml de apa, ce da o rotaţie optica de 100 grade zaharimetrice, atunci când este masurata utilizând un tub de 200 mm. Greutatea variaza după cum urmează, în conformitate cu tipul de zaharimetru utilizat:– 16,29 g pentru zaharimetrele franceze;– 26,00 g pentru zaharimetrele germane;– 20,00 g pentru zaharimetrele mixte; 20° [f2α] = rotaţie optica specifică a amidonului pur (vezi pct 6.1). D6.3. RepetabilitateDiferenţa dintre rezultatele a doua determinări paralele efectuate pe aceeaşi proba trebuie să fie de maximum 0,4, în valoare absolută, pentru un conţinut de amidon mai mic de 40% şi 1,1%, în valoare relativă, pentru continuturi de amidon de minimum 40%.7. Observaţii7.1. Dacă proba conţine mai mult de 6% carbonati, calculati în termeni de carbonat de calciu, aceştia trebuie să fie distrusi prin tratament cu exact cantitatea corespunzătoare de dilutie de acid sulfuric, înainte de determinarea rotatiei optice totale.7.2. În cazul produselor cu un conţinut ridicat de lactoza, precum zerul pudra sau laptele praf degresat, se procedează după cum urmează: după ce se adauga 80 ml de etanol (pct. 3.5), se echipeaza retorta cu un condensator de reflux şi se imerseaza aceasta din urma într-o baie cu apa la 50°C, timp de 30 de minute. Se lasă să se raceasca şi se continua analiza asa cum s-a indicat la pct. 5.3.7.3. În cazul în care următoarele materii furajere sunt prezente în cantitate semnificativă în furaje, pot aparea interferente atunci când se determina conţinutul de amidon prin metoda polarimetrica şi, de aceea, pot fi obţinute rezultate incorecte:a) produse din sfecla (de zahăr), cum ar fi: pulpa de sfecla (de zahăr), melasa de sfecla (de zahăr), pulpa melasata de sfecla (de zahăr), borhot de sfecla (de zahăr), zahăr (de sfecla); … b) pulpa de citrice; … c) samanta de în; turte de în obţinute prin presare; turte de în rezultate după extracţie; … d) samanta de rapita; turte de rapita obţinute prin presare; turte de rapita rezultate după extracţie; hoaspe de samanta de rapita; … e) samanta de floarea-soarelui; turte de floarea-soarelui rezultate după extracţie; samanta de floarea-soarelui parţial decorticata, extrasa; … f) turte de copra obţinute prin presare; turte de copra rezultate după extracţie; … g) pulpa de cartof; … h) drojdie deshidratata; … i) produse bogate în inulina (de exemplu, taitei şi făina de topinambur); … j) jumari. … II. DETERMINAREA PROTEINEI BRUTE1. Scop şi domeniu de aplicareAceasta metoda se utilizează pentru determinarea conţinutului de proteina bruta din furaje pe baza conţinutului de azot, determinat în conformitate cu metoda Kjeldahl.2. PrincipiuProba se digera cu acid sulfuric în prezenta unui catalizator. Soluţia acida trebuie alcalinizata cu soluţie de hidroxid de sodiu. Amoniacul se distileaza şi se colectează într-o cantitate masurata de acid sulfuric, al cărui exces este titrat cu o soluţie standard de hidroxid de sodiu.3. Reactivi3.1. Sulfat de potasiu3.2. Catalizator: oxid de cupru (II) CuO sau sulfat de cupru pentahidrat (II), CuS0(4) . 5H(2)03.3. Zinc granulat3.4. Acid sulfuric, p20 = 1,84 g/ml3.5. Acid sulfuric C[1/2 H(2)S0(4)] = 0,5 mol/l3.6. Acid sulfuric C[1/2 H(2)S0(4)] = 0,1 mol/l3.7. Indicator roşu de metil: se dizolva 300 mg de roşu de metil în 100 ml de etanol, f2'f3 = 95-96% (v/v)3.8. Soluţie de hidroxid de sodiu (poate fi utilizat gradul tehnic) f2â = 40 g/100 ml (m/v: 40%)3.9. Soluţie c de hidroxid de sodiu = 0,25 ml/l3.10. Soluţie c de hidroxid de sodiu = 0,1 mol/l3.11. Piatra ponce granulata, spalata în acid clorhidric şi aprinsa3.12. Acetanilida ( m². = 114°C, N = 10,36%)3.13. Sucroza (libera de azot).4. AparaturaAparatura potrivita pentru efectuarea digestiei, distilarii şi titrarii, în conformitate cu procedura Kjedahl.5. Procedura5.1. DigestieSe cantareste 1 g de proba cu o aproximatie de 0,001 g şi se transfera în retorta aparatului de digestie. Se adauga 15 g de sulfat de potasiu (pct. 3.1), o cantitate corespunzătoare de catalizator (pct. 3.2) [0,3 până la 0,4 g de oxid de cupru (II) sau 0,9 până la 1,2 g de sulfat de cupru pentahidrat(II)], 25 ml de acid sulfuric (pct. 3.4) şi câteva granule de piatra ponce (pct. 3.11) şi se amesteca. Se incalzeste mai întâi retorta cu moderatie, rotindu-se din când în când, dacă este necesar, până când masa de proba s~a carbonizat şi spuma a dispărut. Se incalzeste apoi mai intens până când lichidul fierbe constant, încălzirea este adecvată dacă acidul fiert condenseaza pe peretele retortei. Se previne ca pereţii sa devină supraincalziti şi ca particule organice să se lipeasca pe aceştia. Când soluţia devine clara şi verde deschis, se continua să se fiarba timp de încă doua ore, apoi se lasă să se raceasca.5.2. DistilareSe adauga cu grija destula apa pentru dizolvarea completa a sulfatilor. Se lasă să se raceasca şi apoi se adauga câteva granule de zinc (pct. 3.3).Se plaseaza în retorta de colectare a aparatului de distilare o cantitate exactă masurata de 25 ml de acid sulfuric (pct. 3.5 sau 3.6), depinzand de conţinutul de azot estimat. Se adauga câteva picaturi de indicator de roşu de metil (pct. 3.7).Se conecteaza retorta de digestie la condensatorul aparatului de distilare şi se imerseaza porţiunea terminala a condensatorului în lichidul conţinut în retorta de colectare, la o adancime de cel puţin 1 cm (vezi observatia de la pct. 8.3). Se toarna incet 100 ml de soluţie de hidroxid de sodiu (pct. 3.8) în retorta de digestie, fără a se pierde amoniac (vezi observatia de la pct. 8.1).Se incalzeste retorta până când amoniacul s-a distilat.5.3. TitrareSe titreaza excesul de acid sulfuric în retorta de colectare cu soluţie de hidroxid de sodiu (pct. 3.9 sau 3.10), depinzand de concentraţia de acid sulfuric utilizata, până când este atins punctul final.5.4. Test martorPentru a se confirma ca reactivii sunt liberi de azot, se efectuează un test martor (digestie, distilare şi titrare), utilizându-se 1 g de sucroza (pct. 3.13) în locul probei.6. Calcularea rezultatelorConţinutul în proteina bruta este calculat în conformitate cu următoarea formula:[V(0) – V(1)] x c x 0,014 x 100 x 6,25 ,––––––––––––– munde:V(0) = volumul (ml) de NaOH (pct. 3.9 sau pct. 3.10) utilizat la testul martor;V(1) = volumul (ml) de NaOH (pct. 3.9 sau pct. 3.10) utilizat la titrarea probei;c = concentraţia (mol/l) de hidroxid de sodiu (pct. 3.9 sau pct. 3.10);m = masa probei (g).7. Verificarea metodei7.1. RepetabilitateDiferenţa dintre rezultatele a doua determinări paralele, efectuate pe aceeaşi proba, trebuie să fie de maximum:– 0,2% în valoare absolută, pentru un conţinut de proteina bruta mai mic de 20%;– 1,0% relativ la valoarea mai mare, pentru un conţinut de proteina bruta de la 20% la 40%;– 0,4% în valoare absolută, pentru un conţinut de proteina bruta de peste 40%.7.2. AcurateteSe efectuează analiza (digestie, distilare şi titrare) pe 1,5 până la 2 g de acetanilida (pct. 3.12), în prezenta a 1 g de sucroza (pct. 3.13); 1 g de acetanilida consuma 14,8 ml de acid sulfuric (pct. 3.5). Recuperarea trebuie să fie de cel puţin 99%.8. Observaţii8.1. Aparatura poate fi de tip manual, semiautomat sau automat. Dacă aparatura necesita transferul între fazele de digestie şi de distilare, acest transfer trebuie să fie efectuat fără pierdere. Dacă retorta aparatului de distilat nu este echipata cu o palnie, se adauga imediat, înainte de conectarea retortei la condensator, hidroxid de sodiu, turnand incet pe pereţi.8.2. Dacă materialul digerat se solidifică, se reîncepe determinarea, utilizându-se o cantitate mai mare de acid sulfuric (pct. 3.4) decât cea specificată anterior.8.3. Pentru produse cu un conţinut scăzut de azot, volumul de acid sulfuric (pct. 3.6) ce trebuie plasat în retorta de colectare poate fi redus până la 10 sau 15 ml, dacă este necesar, şi se aduce la volum cu apa până la 25 ml.III. DETERMINAREA PROTEINEI BRUTE DESCOMPUSE DE PEPSINA ŞI ACID CLORHIDRIC1. Scop şi domeniu de aplicareAceasta metoda se utilizează pentru determinarea fracţiunii de proteina bruta descompusa de pepsina şi acid clorhidric în baza condiţiilor definite. Aceasta este aplicabilă tuturor furajelor.2. PrincipiuProba trebuie incalzita timp de 48 de ore, la 40°C, într-o soluţie clorhidrica de pepsina. Suspensia trebuie filtrata, iar conţinutul în azot al filtratului, determinat în conformitate cu metoda pentru determinarea proteinei brute.3. Reactivi3.1. Acid clorhidric, d: 1,1253.2. Acid clorhidric, 0,075 N3.3. 2,0 U/mg pepsina. Activitatea pepsinei este definită de metoda descrisă în partea a 4-a a acestei anexe şi trebuie să fie stabilită în conformitate cu acea metoda.3.4. Aproximativ 0,2% (w/v) soluţie proaspăt preparata de acid clorhidric (pct. 3.2); Activitate: 400 U/L3.5. Emulsie antispuma (de exemplu, silicon).3.6. Toţi reactivii menţionaţi la pct. 3 pentru metoda de determinare a proteinei brute.4. Aparatura4.1. Baie de apa sau incubator, fixat la 40°C ± 1°C4.2. Aparatura de digestie şi de distilare Kjedahl.5. Procedura5.1. Prepararea soluţiei (vezi observatia 7.2)Se cantaresc 2 g din proba, cu o aproximatie de mg, şi se plaseaza într-o retorta gradata de 500 ml. Se adauga 450 ml de soluţie clorhidrica de pepsina (pct. 3.4), incalzita anterior la 40°C, şi se agita pentru a se preveni formarea flocoanelor. Se controlează ca ph-ul suspensiei să fie mai mic de 1,7. Se plaseaza retorta într-o baie de apa sau incubator (pct. 4.1) şi se lasă acolo timp de 48 de ore. Se agita după 8, 24 şi 32 de ore. După 48 de ore se adauga 15 ml de acid clorhidric (pct. 3.1), se raceste până la 20°C, se aduce la volum cu apa şi se filtreaza.5.2. DigestiaSe iau 250 ml de filtrat şi se plaseaza în retorta aparatului de distilare (pct. 4.2). Se adauga reactivii necesari pentru digestia indicată în a doua propozitie a pct. 5.1 din metoda pentru determinarea proteinei brute. Se omogenizeaza şi se aduce la fierbere. Dacă se formează orice spuma, se adauga câteva picaturi de emulsie antispuma (pct. 3.5). Se continua fierberea cu vigoare până când apa s-a evaporat aproape complet. Se reduce căldură şi se elimina cu atenţie ultimele urme de apa.Când soluţia devine clara şi incolora (sau verde deschis, dacă este utilizat un catalizator pe bază de cupru), se continua fierberea timp de încă o ora. Se lasă să se raceasca.5.3. Distilare şi titrareSe procedează, asa cum s-a indicat la pct. 5.2 şi 5.3 din metoda pentru determinarea proteinei brute.5.4. Test martorSe efectuează un test martor, aplicându-se aceeaşi procedura, dar omitandu-se proba ce trebuie analizata.6. Calcularea rezultatelorSe scade volumul de acid sulfuric consumat la testul martor din cel consumat la proba-test. 1 ml de acid sulfuric 0,1 N corespunde la 1,4 mg de azot.Se multiplica cantitatea de azot cu factorul 6,25. Se exprima rezultatul ca procent din proba.RepetabilitateDiferenţa dintre rezultatele a doua determinări paralele, efectuate pe aceeaşi proba, trebuie să fie de maximum:– 0,4, în valoare absolută, pentru un conţinut mai mic de 20%;– 2,0%, în valoare absolută, pentru un conţinut peste 20% şi nu mai mult de 40%;– 0,8, în valoare absolută, pentru un conţinut de peste 40%.7. Observaţii7.1. Valorile obţinute prin aceasta metoda nu au conexiune directa cu digestibilitatea în vivo.7.2. Produsele cu un conţinut în ulei sau grasime ce depăşeşte 10% trebuie mai întâi să fie degresate prin extracţie cu eter petrol (B.P. 40°C până la 60°C).IV. ESTIMAREA ACTIVITĂŢII PEPSINEI1. Scop şi domeniu de aplicareAceasta metoda se utilizează la stabilirea activităţii de pepsina utilizata în determinarea proteinei brute descompuse de pepsina şi acid clorhidric.2. PrincipiuHemoglobina trebuie tratata cu pepsina, într-un mediu de acid clorhidric, în baza condiţiilor definite. Fracţiunea nehidrolizata a proteinei este precipitata în acid tricloracetic. Sunt adăugate filtratului hidroxid de sodiu şi reactiv Folin-Ciocalteu. Densitatea optica a acestei soluţii trebuie masurata la lungimea de unda de 750 nm, iar cantitatea corespunzătoare de tirozina trebuie citită de pe curba de calibrare.Definiţie: Unitatea de pepsina este definită ca fiind cantitatea din acea enzima ce, în baza condiţiilor metodei, eliberează pe minut o anumită cantitate din grupele hidroxiaril care, atunci când intră în contact cu reactivul Folin-Ciocalteu, are o densitate optica corespunzătoare celei la care un f2æmol de tirozina reactioneaza în aceeaşi maniera.3. Reactivi3.1. Acid clorhidric 0,2 N3.2. Acid clorhidric 0,06 N3.3. Acid clorhidric 0,025 N3.4. Soluţie 5% (w/v) de acid tricloracetic3.5. Soluţie de hidroxid de sodiu 0,5 N3.6. Reactiv Folin-Ciocalteu.Se plaseaza 100 g de tungstat de sodiu (Na(2)WO(4). 2H(2)O), 25 g de molibdat de sodiu (Na(2)MoO(4). 2H(2)O) şi 700 ml de apa într-o retorta cu fundul rotund de 2 litri echipata cu o imbinare standard de sticlă mata. Se adauga 50 ml de acid fosforic (d:1,71) şi 100 ml de acid clorhidric concentrat (d: 1,19), se conecteaza un condensator de reflux la retorta, se aduce la fierbere şi se tine soluţia fierband uşor timp de 10 ore. Se lasă să se raceasca, se detaseaza condensatorul de reflux, se adauga 175 g de sulfat de litiu (Li(2)SO(4). 2H(2)O), 50 ml de apa şi 1 ml de bromura. Se fierbe timp de 15 minute pentru a se elimina excesul de bromura.Se lasă să se raceasca, se transfera soluţia într-o retorta gradata de un litru, se aduce la volum cu apa, se omogenizeaza şi se filtreaza. Nu trebuie să rămână nicio coloratie verzuie. Înainte de utilizare se dilueaza un volum de reactiv cu doua volume de apa.3.7. Soluţie de hemoglobinaSe cantareste o cantitate de hemoglobina (aproximativ 2 g de substrat proteic determinat în conformitate cu Anson) ce corespunde la 354 mg de azot *1) şi se plaseaza într-o retorta de 200 ml echipata cu o imbinare standard de sticlă mata.–––*1) Se determina conţinutul în azot prin metoda semi-micro Kjeldahl (conţinutul teoretic: 17,7% de azot).Se adauga cativa ml de acid clorhidric (pct. 3.2), se conecteaza retorta la pompa de vacuum şi se agita până când hemoglobina a fost dizolvată complet. Se eliberează vacuumul şi se adauga, în timp ce se agita, acid clorhidric (pct. 3.2), se completează până la 100 ml. Se prepara imediat înainte de utilizare.3.8. Soluţie standard de tirozinaSe dizolva 181,2 mg de tirozina în acid clorhidric (pct. 3.1) şi se completează până la un litru cu acelaşi acid (soluţie Stick). Se iau 20 ml şi se dilueaza până la 100 ml cu acid clorhidric (pct. 3.1). 1 ml din aceasta soluţie conţine 0,2 f2æmoli de tirozina.4. Aparatura4.1. Baie de apa fixată la 25°C ± 0,1°C prin ultratermostat4.2. Spectrofotometru4.3. Cronometru, acuratete: o secunda4.4. Ph-metru.5. Procedura5.1. Prepararea soluţiei (vezi observatia de la pct. 7.1)Se dizolva 150 mg de pepsina în 100 ml de acid clorhidric (pct. 3.2). Se pipeteaza 2 ml din soluţie într-o retorta gradata de 50 ml şi se aduce la volum cu acid clorhidric (pct. 3.3). Ph-ul, controlat cu ph-metru, trebuie să fie de 1,6 ± 0,1. Se imerseaza retorta într-o baie de apa (pct. 4.1).5.2. HidrolizaSe pipeteaza 5,0 ml de soluţie de hemoglobina (pct. 3.7) într-o eprubeta, se incalzeste într-o baie de apa la 25°C (pct. 4.1), se adauga 1 ml de soluţie de pepsina obţinută ca la pct. 5.1 şi se amesteca cu o bagheta de sticlă ingrosata la un capăt, cu aproximativ 10 miscari înainte şi înapoi. Se lasă eprubeta într-o baie de apa la 25°C, exact 10 minute, măsurate de la adăugarea soluţiei de pepsina (trebuie să fie respectate cu stricteţe durata şi temperatura). Apoi se adauga 10,0 ml de soluţie de acid tricloracetic (pct. 3.4), incalzita anterior la 25°C, se omogenizeaza şi se filtreaza printr-un filtru uscat.5.3. Evoluţia colorarii şi măsurarea densitatii opticeSe pipeteaza 5,0 ml de filtrat într-o retorta Erlenmeyer de 50 ml, se adauga 10,0 ml de soluţie de hidroxid de sodiu (pct. 3.5) şi, agitandu-se constant, 3 ml de reactiv Folin-Ciocalteu diluat (pct. 3.6). După 5 până la 10 minute, se determina densitatea optica a soluţiei cu spectro-fotometru la 750 nm în celule de 1 cm impermeabile.5.4. Test martorPentru fiecare determinare se efectuează un test martor, după cum urmează: Se pipeteaza 5 ml de soluţie de hemoglobina (pct. 3.7) într-o eprubeta, se incalzeste într-o baie de apa la 25°C (pct. 4.1), se adauga 10,0 ml de soluţie de acid tricloracetic (pct. 3.4) incalzita anterior la 25°C, se omogenizeaza, apoi se adauga 1,0 ml de soluţie de pepsina obţinută la pct. 5.1. Se amesteca cu o bagheta de sticlă şi se lasă eprubeta în baia de apa (pct. 4.1) la 25°C pentru exact 10 minute. Se omogenizeaza şi se filtreaza printr-un filtru uscat. Se urmează procedura indicată la pct. 5.3.5.5. Curba de calibrareSe plaseaza 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 şi 5,0 ml alicote de soluţie standard de tirozina (pct. 3.8), corespunzând la 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 şi 1,0 f2æmoli de tirozina respectiv, în retorte Erlenmeyer de 50 ml. Se încheie seriile cu o soluţie de referinţa libera de tirozina. Se aduce la volum până la 5 ml cu acid clorhidric (pct. 3.1). Se adauga 10,0 ml de soluţie de hidroxid de sodiu (pct. 3.5) şi, agitandu-se constant, 3 ml de dilutie de reactiv Folin-Ciocalteu (pct. 3.6). Se măsoară densitatea optica, asa cum s-a indicat la ultima propozitie a pct. 5.3. Se traseaza curba de calibrare prin schitarea densitatilor optice corelate cu cantităţile de tirozina.6. Calcularea rezultatelorDe pe curba de calibrare se citeşte cantitatea de tirozina în f2æmoli ce corespunde densitatii optice a soluţiei colorate, corectată pe baza valorii martor.Activitatea pepsinei, în f2æmoli de tirozina la 25°C per mg şi per minut, se calculează utilizându-se formula: 0,32aUnităţi per mg (U/mg) = ––– , Punde:a = cantitatea de tirozina în f2æmoli ce se citeşte de pe curba de calibrare;P = greutatea în mg a cantităţii de pepsina adăugată la pct. 5.2.7. Observaţii7.1. Cantitatea de pepsina ce trebuie dizolvată trebuie să fie astfel încât, la măsurarea fotometrica finala, să fie obţinută o densitate optica de 0,35 ± 0,035.7.2. Doua unităţi per mg, obţinute prin aceasta metoda, corespund la: 3,64 miliunitati Anson/mg (f2æmoli de tirozina/mg . min. la 35,5°C) sau 36.400 unităţi comerciale/g (f2æmoli de tirozina/g în 10 min. la 35,5°C).V. DETERMINAREA DE GOSIPOL LIBER1. Scop şi domeniu de aplicareAceasta metoda se utilizează pentru determinarea nivelurilor de gosipol liber, de gosipol total şi de substanţe chimic legate de acesta din samanta de bumbac, făina de samanta de bumbac şi brichete de samanta de bumbac şi din furaje combinate ce conţin aceste substanţe, atunci când sunt prezente în cantitate mai mare de 20 ppm.2. PrincipiuGosipolul trebuie extras în prezenta 3-aminopropan-1-ol, fie cu un amestec de propan-2-ol şi hexan, pentru determinarea gosipolului liber, sau cu dimetilformamida, pentru determinarea gosipolului total. Gosipolul este convertit de anilina în gosipol-dianilina, a carei densitate optica este masurata la lungimea de unda de 440 nm.3. Reactivi3.1. Amestec de propan-2-olhexan: se amesteca 60 de părţi de volum de propan-2-ol A.R. cu 40 de părţi de volum de n-hexan.3.2. Solvent A: se plaseaza într-o retorta gradata de 1 litru aproximativ 500 ml de amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1), 2 ml de aminopropan-1-ol, 8 ml de acid acetic glacial şi 50 ml de apa. Se aduce la volum cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1). Acest reactiv este stabil timp de o săptămâna.3.3. Solvent B: se pipeteaza 2 ml de 3-aminopropan-1-ol şi 10 ml de acid acetic glacial într-o retorta gradata de 100 ml. Se raceste la temperatura camerei şi se aduce la volum cu N, N-dimetilformamida. Acest reactiv este stabil timp de o săptămâna.3.4. Anilina A.R.: Dacă densitatea optica a testului martor depăşeşte 0,022, se distileaza anilina peste praf de zinc, aruncand prima şi ultima fracţiune de 10% a distilatului. Refrigerat şi depozitat într-o retorta maro cu dop de sticlă, acest reactiv se va tine timp de câteva luni.3.5. Soluţie standard A de gosipol: Se plaseaza 27,9 mg de acetat de gosipol într-o retorta gradata de 250 ml. Se dizolva şi se aduce la volum cu solvent A (pct. 3.2). Se pipeteaza 50 ml din aceasta soluţie într-o retorta gradata de 250 ml şi se aduce la volum cu solvent A. Concentraţia în gosipol a acestei soluţii este de 0,02 mg per ml. Se lasă sa stea timp de o ora la temperatura camerei înainte de utilizare.3.6. Soluţie B standard de gosipol: Se plaseaza 27,9 mg de acetat de gosipol într-o retorta gradata de 50 ml. Se dizolva şi se aduce la volum cu solvent B (pct. 3.3). Concentraţia de gosipol a acestei soluţii este de 0,5 mg per ml.Soluţiile standard A şi B de gosipol vor rămâne stabile timp de 24 de ore, dacă au fost ferite de lumina.4. Aparatura4.1. Mixer (cu pahar): aproximativ 35 rpm.4.2. Spectrofotometru.5. Procedura5.1. Proba-testCantitatea de proba-test utilizata depinde de conţinutul estimat de gosipol al probei. Este preferabil să se lucreze cu o proba-test mica şi cu o parte relativ mare de alicota a filtratului, astfel încât să se obţină suficient gosipol, pentru ca să fie posibila măsurarea fotometrica precisa. Pentru determinarea de gosipol liber din samanta de bumbac, făina de samanta de bumbac şi din brichetele de samanta de bumbac, proba-test nu trebuie să depăşească 1 g. Pentru furaje combinate, aceasta poate fi de maximum 5 g. O parte de alicota de 10 ml din filtrat este corespunzătoare în majoritatea cazurilor. Aceasta trebuie să conţină 50 până la 100 f2æg de gosipol. Pentru determinarea gosipolului total, proba-test trebuie să fie între 0,5 şi 5 g, pentru ca o parte de 2 ml de alicota din filtrat sa conţină 40 până la 200 f2æg de gosipol.Analiza trebuie să fie efectuată la o temperatura a camerei de aproximativ 20°C.5.2. Determinarea de gosipol liberSe plaseaza proba-test într-o retorta cu gat stramt de 250 ml, fundul retortei fiind acoperit cu sticlă pisata. Utilizându-se o pipeta, se adauga 50 ml de solvent A (pct. 3.2), se astupa retorta şi se amesteca timp de o ora cu mixerul. Se filtreaza printr-un filtru uscat şi se colectează filtratul într-o retorta cu gatul stramt. Se acoperă palnia în timpul filtrarii cu o sticlă de ceas. Se pipeteaza părţi identice de alicota din filtrat ce conţine 50 până la 100 f2æg de gosipol în fiecare din cele doua retorte gradate de 25 ml (A şi B). Dacă este necesar, se aduce la volum până la 10 ml cu solventul A (pct. 3.2). Apoi se aduce la volum conţinutul retortei (A) cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1). Aceasta soluţie este utilizata ca soluţie de referinţa faţă de care se măsoară soluţia probei.Se pipeteaza 10 ml de solvent A (pct. 3.2) în fiecare dintre celelalte doua retorte gradate de 25 ml (C şi D). Se aduce la volum conţinutul retortei (C) cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1). Aceasta soluţie este utilizata ca soluţie de referinţa faţă de care se măsoară soluţia testului martor.Se adauga 2 ml de anilina (pct. 3.4) în fiecare dintre retorte (D) şi (B). Se incalzeste timp de 30 de minute deasupra unei băi de apa fierbinte, pentru a dezvolta culoarea. Se raceste la temperatura camerei, se aduce la volum cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1), se omogenizeaza şi se lasă sa stea timp de o ora.Se determina densitatea optica a soluţiei testului martor (D) prin comparare cu soluţia de referinţa (C) şi densitatea optica a soluţiei probei (B) prin comparare cu soluţia de referinţa (A), cu spectrofotometru la o lungime de unda de 440 nm, utilizându-se celule de sticlă de 1 cm.Se scade densitatea optica a soluţiei testului martor din cea a soluţiei probei (= densitatea optica corectată). Din aceasta valoare se calculează conţinutul în gosipol liber, asa cum s-a indicat la pct. 6.5.3. Determinarea gosipolului totalSe plaseaza o proba-test ce conţine 1 până la 5 mg de gosipol într-o retorta gradata de 50 ml şi se adauga 10 ml de solvent B (pct. 3.3). În acelaşi timp, se prepara un test martor, plasand 10 ml de solvent B (pct. 3.3) în alta retorta gradata de 50 ml. Se incalzesc cele doua retorte timp de 30 de minute deasupra unei băi de apa fierbinte. Se raceste la temperatura camerei şi se aduce la volum conţinutul fiecărei retorte cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1), se omogenizeaza şi se lasă sa sedimenteze timp de 10 până la 15 minute, apoi se filtreaza şi se colectează filtratele în retorte de sticlă mata cu gat stramt.Se pipeteaza 2 ml de filtrat al probei în fiecare dintre cele doua retorte gradate de 25 ml şi încă 2 ml de filtrat al probei martor în fiecare dintre alte doua retorte de 25 ml. Se aduce la volum conţinutul unei retorte din fiecare serie până la 25 ml, cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1). Aceste soluţii sunt utilizate ca soluţii de referinţa.Se adauga 2 ml de anilina (pct. 3.4) în fiecare dintre cele doua retorte. Se incalzeste timp de 30 de minute deasupra unei băi de apa fierbinte, pentru a dezvolta culoarea. Se raceste la temperatura camerei, se aduce la volumul de 25ml cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1), se omogenizeaza şi se lasă sa sedimenteze timp de o ora.Se determina densitatea optica, asa cum s-a indicat la pct. 5.2 pentru gosipolul liber. Din aceasta valoare se calculează conţinutul de gosipol liber, asa cum s-a indicat la pct. 6.6. Calcularea rezultatelorRezultatele pot fi calculate fie pornindu-se de la densitatea optica specifică (pct. 6.1), fie prin referire la o curba de calibrare (pct. 6.2).6.1. Utilizarea densitatii optice specificeDensitatile optice specifice, în baza condiţiilor descrise, sunt următoarele: 1% gosipol liber: E –– = 625 1 cm 1% gosipol total: E –– = 600 1 cmConţinutul de gosipol liber şi total al probei este calculat după următoarea formula: E x 1250 % gosipol = –––––- , 1% E(1 cm) x p x aunde:E = densitatea optica corectată, determinata asa cum s-a indicat la pct. 5.2;p = proba-test, în g;a = parte de alicota a filtratului, în ml;6.2. Utilizarea curbei de calibrare6.2.1. Gosipol liberSe prepara doua serii de cinci retorte gradate de 25 ml.Se pipeteaza alicote de 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 şi 10,0 de soluţie standard A de gosipol (pct. 3.5) în fiecare serie de retorte. Se aduce la volum până la 10 ml cu solvent A (pct. 3.2). Se completează fiecare serie cu o retorta gradata de 25 ml care conţine numai 10 ml de solvent A (pct. 3.2) (test martor).Se aduc la volum retortele din primele serii (incluzând retorta pentru testul martor) până la 25 ml cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1) (serii de referinţa).Se adauga 2 ml de anilina (pct. 3.4) pentru fiecare retorta din a doua serie (incluzând retorta pentru testul blanc). Se incalzeste timp de 30 de minute într-o baie de apa fierbinte pentru a dezvolta culoarea. Se raceste la temperatura camerei, se aduce la volum cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1), se omogenizeaza şi se lasă sa stea timp de o ora (serii standard).Densitatea optica a soluţiilor din seriile standard se determina, asa cum s-a indicat la pct. 5.2, prin comparare cu soluţiile corespunzătoare din seriile de referinţa. Se traseaza curba de calibrare prin schitarea densitatii optice în raport cu cantităţile de gosipol (în f2æg).6.2.2. Gosipol totalSe prepara 6 retorte gradate de 50 ml. În prima retorta se plaseaza 10 ml de solvent B (pct. 3.3), iar în celelalte se plaseaza respectiv 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 şi 10,0 ml de soluţie standard B de gosipol (pct. 3.6). Se umple conţinutul fiecărei retorte până la 10 ml cu solvent B (pct. 3.3). Se incalzeste timp de 30 de minute într-o baie de apa fierbinte. Se raceste la temperatura camerei, se umple volumul cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1) şi se omogenizeaza.Se plaseaza 2,0 ml din aceste soluţii în fiecare dintre cele doua serii de 6 retorte gradate de 25 ml. Se umple conţinutul retortelor din prima serie până la 25 ml cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1) (serii de referinţa).Se adauga 2 ml de anilina (pct. 3.4) în fiecare retorta dintre cele doua serii. Se incalzeste timp de 30 de minute într-o baie cu apa fierbinte. Se raceste la temperatura camerei, se aduce la volum cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1), se omogenizeaza şi se lasă sa stea timp de o ora (serii standard).Se determina densitatea optica a soluţiilor din seriile standard, asa cum s-a indicat la pct. 5.2, prin comparare cu soluţiile corespunzătoare din seriile de referinţa. Se traseaza curba de calibrare prin schitarea densitatii optice în raport cu cantităţile de gosipol (în f2æg).6.3. RepetabilitateDiferenţa dintre rezultatele celor două determinări paralele efectuate pe aceeaşi proba trebuie să fie de maximum:a) 15%, în valoare absolută, pentru conţinut de gosipol mai mic de 500 ppm; … b) 75 ppm, în valoare absolută, pentru conţinut de gosipol de minimum 500 ppm şi maximum 750 ppm; … c) 10%, în valoare absolută, pentru conţinut de gosipol mai mare de 750 ppm. … +
Anexa 2la norma sanitară veterinaraI. DETERMINAREA TILOZINEI– prin difuziune pe agar –1. Scop şi domeniu de aplicareAceasta metoda se utilizează pentru determinarea conţinutului de tilozina din furaje, concentrate şi premixuri, atunci când este prezenta în cantitate mai mare de 2 ppm.2. PrincipiuProba trebuie tratata cu o soluţie tampon fosfat la pH 8, incalzita anterior la 80°C şi apoi extrasa cu metanol. După centrifugare, extrasul trebuie diluat şi determinata activitatea antibiotica a acestuia prin măsurarea difuziei tilozinei pe mediu de agar insamantat cu Sarcina lutea. Difuzia este evidenţiată prin formarea de zone de inhibitie în prezenta microorganismului. Diametrul acestor zone este direct proporţional cu logaritmul concentratiei de antibiotic.3. Microorganism: Sarcina lutea ATCC nr. 93413.1. Întreţinerea tulpinii parentaleSe inoculeaza cu Sarcina lutea un tub de agar înclinat prelevat din mediul de cultura (pct. 4.1), se ajusteaza până la pH 7,0. Se incubeaza peste noapte la aproximativ 35°C. Se tine cultura într-un refrigerator şi se reinoculeaza agarul înclinat cu aceasta în fiecare luna.3.2. Prepararea suspensiei bacterieneSe colectează bacteriile dintr-o eprubeta cu agar înclinat, recent preparata (pct. 3.1), utilizându-se 2 până la 3 ml de soluţie fiziologica salina (pct. 4.4). Cu aceasta suspensie se insamanteaza o retorta Roux ce conţine 250 ml mediu de cultura (pct. 4.1), ajustat la pH 7,0. Se incubeaza timp de 24 de ore, la 35°C, apoi se colectează bacteriile în 25 ml de ser fiziologic (pct. 4.4). Se omogenizeaza şi se dilueaza aceasta suspensie pentru a se obţine o transmisie a luminii de aproximativ 75% la 650 nm.Aceasta soluţie poate fi utilizata timp de o săptămâna, dacă a fost ţinuta într-un refrigerator.Prin teste preliminarii pe plăcuţe cu mediu primar pentru determinare (pct. 4.1) se stabileşte cantitatea de inocul care, pentru diferite concentratii de tilozina utilizate, va induce cele mai mari zone de inhibitie posibile ce sunt încă clare. Mediul de cultura este inoculat la temperaturi între 48 până la 50°C.4. Medii de cultura şi reactivi4.1. Mediu primar pentru determinare (^1) Glucoza 1 g Peptona triptica 10 g Extract de carne 1,5 g Extract de drojdie 3 g Agar, conform cu calitatea 10 până la 20 g Apa distilata până la 1.000 mlSe ajusteaza pH-ul la 7, imediat înainte de utilizare, pentru a se întreţine tulpina parentala şi prepararea suspensiei de bacterii şi la pH 8 pentru determinare.4.2. Soluţie tampon fosfat, pH 8 Fosfat de potasiu dehidrogenat 0,523 g KH(2)PO(4) A.R. Fosfat de dipotasiu hidrogenat 16,730 g K(2)HPO(4) A.R. Apa distilata până la 1.000 ml4.3. Soluţie tampon fosfat, pH 7 Fosfat de potasiu dehidrogenat 5,5 g KH(2)PO(4) A.R. Fosfat de dipotasiu hidrogenat 13,6 g K(2)HPO(4) A.R. Apa distilata până la 1.000 ml4.4. Ser fiziologic steril.4.5. Metanol pur.4.6. Metanol 40% (v/v)4.7. Amestec de soluţie tampon fosfat (pct. 4.2)/ metanol pur: 60/40 ca volum.4.8. Substanţa standard: tilozina cu activitate cunoscută.5. Soluţii standardSe usucă substanţa standard (pct. 4.8) timp de 3 ore la 60°C într-un cuptor cu vacuum (5 mm de mercur). Se cantaresc 10 până la 50 mg într-o retorta gradata, se dizolva în 5 ml de metanol (pct. 4.5) şi se dilueaza soluţia cu soluţie tampon fosfat, pH 7 (pct. 4.3), pentru a se obţine o concentraţie de tilozina baza de 1.000 f2æg per ml.Se prepara din aceasta soluţie de stoc o soluţie standard de lucru S(8) ce conţine 2 f2æg per ml de tilozina baza prin diluare cu amestecul (pct. 4.7).Se prepara apoi prin dilutii succesive (1+1), utilizându-se amestecul (pct. 4.7), următoarele concentratii: S(4) 1 f2æg/ml S(2) 0,5 æg/ml S(1) 0,25 æg/ml6. ExtracţiePentru concentrate, se ia o proba-test de 10 g; pentru premixuri şi furaje, o proba test de 20 g. Se adauga 60 ml de soluţie tampon fosfat, pH 8 (pct. 4.2), incalzita anterior până la 80°C, şi se omogenizeaza timp de doua minute (cu mixer domestic, Ultra-turrax etc).Se lasă sa sedimenteze timp de 10 minute, se adauga 40 ml de metanol (pct. 4.5) şi se omogenizeaza timp de 5 minute. Se centrifugheaza extractul şi se dilueaza o parte alicota cu amestecul (pct. 4.7), pentru a se obţine o concentraţie prezumtiva de tilozina de 2 f2æg per ml (= U(8)). Se prepara apoi concentratiile U(4), U(2) şi U(1) prin dilutii succesive (1 + 1), utilizându-se amestecul (pct. 4.7).Pentru un conţinut mai mic de 10 ppm, se evapora extractul până se usucă, într-un evaporator rotativ la 35°C, şi se dizolva reziduul în metanol 40% (pct. 4.6).7. Metoda de determinare7.1. Inocularea mediului de culturaSe inoculeaza mediul primar pentru determinare, la 48 până la 50°C (pct. 4.1), se ajusteaza până la pH 8,0, cu suspensie de bacterii (pct. 3.2).7.2. Prepararea placilorDifuzia în agar este efectuată pe plăci, utilizându-se 4 concentratii de soluţii standard [S(8), S(4), S(2), S(1)] şi 4 concentratii ale extractului [U(8), U(4), U(2), U(1)]. Cele 4 concentratii ale soluţiei standard şi ale extractului trebuie să fie plasate în fiecare placa.De aceea, se aleg tavi ce sunt destul de mari pentru a permite ca cel puţin 8 godeuri cu diametrul de 10 până la 13 mm să fie realizate în mediu de agar. Se calculează necesarul de mediu de cultura de inoculat (pct. 7.1) pentru a se furniza o acoperire uniforma de aproximativ 2 mm grosime. Testul trebuie să fie efectuat, de preferinta, pe plăci ce constau din plăci plate de sticlă, echipate cu un inel din aluminiu sau plastic perfectat la nivel, cu diametrul de 200 mm şi înalt de 20 mm.Se pipeteaza în godeuri cantităţile măsurate cu acuratete între 0,1 şi 0,15 ml de soluţie antibiotica, depinzand de diametrul godeurilor.Pentru fiecare proba se repeta difuzia de cel puţin 4 ori cu fiecare concentraţie, în asa fel încât fiecare determinare sa cuprindă o evaluare de 32 de zone de inhibitie.7.3. IncubareSe incubeaza tavile peste noapte, la 35 până la 37°C.8. EvaluareSe măsoară diametrul zonelor de inhibitie, de preferinta prin proiectare. Se înregistrează măsurătorile pe hârtie semilogaritmica, impartind logaritmul concentratiilor la diametrul zonelor de inhibitie. Se urmăresc liniile soluţiei standard şi ale extractului. Cele doua linii sunt paralele, cu condiţia sa nu existe nicio interferenta.Logaritmul activităţii relative este calculat utilizându-se următoarea formula: [U(1) + U(2) + U(4) + U(8) – S(1) – S(2) – S(4) – S(8)] x 0,602 –––––––––––––––––––––- U(4) + U(8) + S(4) + S(8) – U(1) – U(2) – S(1) – S(2)Activitate reală = activitate prezumată x activitate relativă.9. RepetabilitateDiferenţa dintre rezultatele a doua determinări paralele, efectuate pe aceeaşi proba, nu trebuie să depăşească 10% în valoare relativă.II. DETERMINAREA VIRGINIAMICINEI– prin difuziune pe un mediu de agar –1. Scop şi domeniu de aplicareMetoda se utilizează pentru determinarea virginiamicinei din furaje şi premixuri. Limita cea mai joasa de determinare este 2 mg/kg (2 ppm)(^1).–––(^1) 1 mg de virginiamicina este echivalent cu 1.000 de unităţi UK.2. PrincipiuProba trebuie extrasa cu o soluţie metanolica de Tween 80.Extractul este decantat sau centrifugat şi diluat. Activitatea antibiotica a acestuia se determina prin măsurarea difuziei virginiamicinei într-un mediu de agar inoculat cu Micrococcus luteus. Difuzia este relevata prin formarea de zone de inhibitie ale microorganismului. Diametrul acestor zone este estimat a fi direct proporţional cu logaritmul concentratiei de antibiotic peste limita concentratiilor de antibiotic utilizate.3. Microorganism: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)3.1. Întreţinerea culturii stocSe inoculeaza eprubete ce conţin medii de cultura înclinate (pct. 4.1) cu Micrococcus luteus şi se incubeaza timp de 24 de ore la 30°C. Se păstrează cultura într-un refrigerator, la aproximativ 4°C. Se reinoculeaza la fiecare doua săptămâni.3.2. Prepararea suspensiei bacteriene (^a)–––(^a) Pot fi utilizate alte metode, cu condiţia sa fi fost stabilit ca acestea dau suspensii bacteriene similare.Se recolteaza creşterea bacteriana dintr-un agar înclinat, recent preparat (pct. 3.1) cu 2 până la 3 ml de soluţie de clorura de sodiu (pct. 4.3). Se utilizează aceasta suspensie pentru a se inocula 250 ml de cultura de mediu (pct. 4.1) continuta într-o retorta Roux şi se incubeaza timp de 18 până la 20 de ore la 30°C. Se recolteaza creşterea bacteriana în 25 ml de soluţie de clorura de sodiu (pct. 4.3) şi se amesteca. Se dilueaza suspensia până la 1/10 cu soluţie de clorura de sodiu (pct. 4.3). Transmisia de lumina a suspensiei trebuie să fie de aproximativ 75%, masurata la 650 nm, într-o celula de 1 cm, faţă de soluţie de clorura de sodiu. Aceasta suspensie poate fi păstrată timp de o săptămâna, la aproximativ 4°C.4. Medii de cultura şi reactivi4.1. Mediu de cultura şi de proba (^b)––-(^b) Poate fi utilizat orice mediu de cultura comercial de compoziţie similară şi care da aceleaşi rezultate. Peptona de carne 6 g Triptona 4 g Extract de drojdie 3 g Extract de carne 1,5 g Glucoza 1 g Agar 10 până la 20 g Apa 1.000 ml pH 6,5 (după stilizare).4.2. Fosfat tampon, pH 6 Fosfat acid de potasiu, K(2)HPO(4) 2g Fosfat diacid de potasiu, KH(2)PO(4) 8g Apa până la 1.000 ml4.3. Soluţie de clorura de sodiu 0,8% (w/v): se dizolva 8 g de clorura de sodiu în apa şi se dilueaza până la 1.000 ml, apoi se sterilizeaza.4.4. Metanol4.5. Amestec de fosfat tampon (pct. 4.2)/metanol (pct. 4.4): 80/20 (v/v).4.6. Soluţie metanolica Tween 80 0,5% (w/v): se dizolva 5 g de Tween 80 în metanol (pct. 4.4) şi se dilueaza cu metanol până la 1.000 ml.4.7. Substanţa standard: virginiamicina cu activitate cunoscută.5. Soluţii standardSe dizolva o cantitate din substanţa standard cantarita cu acuratete (pct. 4.7) în metanol (pct. 4.4) şi se dilueaza cu metanol (pct. 4.4), pentru a se obţine o soluţie stoc ce conţine 1.000 f2æg de virginiamicina per ml.Depozitata într-o retorta astupata la 4°C, aceasta soluţie este stabilă până la 5 zile.Din aceasta soluţie stoc se prepara, prin dilutie succesiva cu amestecul (pct. 4.5), următoarele soluţii: S(8) 1 f2æg/ml; S(4) 0,5 æg/ml; S(2) 0,25 æg/ml; S(1) 0,125 æg/ml.6. Prepararea extractului şi a soluţiilor de testare6.1. Extracţie6.1.1. Produse cu un conţinut de virginiamicina de până la 100 mg/kgSe cantareste o cantitate din proba de 50 g, se adauga 200 ml de soluţie (pct. 4.6) şi se agita timp de 30 de minute. Se lasă să se sedimenteze sau se centrifugheaza, se iau 20 ml de soluţie de supernatant şi se evapora până la aproximativ 5 ml, într-un evaporator rotativ, la o temperatura ce nu depăşeşte 40°C. Se dilueaza reziduul cu amestecul (pct. 4.5), pentru a se obţine un conţinut de virginiamicina estimat la 1 f2æg/ml [= U(8)].6.1.2. Produse cu un conţinut de virginiamicina mai mare de 100 mg/kgSe cantareste o cantitate de proba ce nu depăşeşte 10 g şi care conţine între 1-50 mg de virginiamicina, se adauga 100 ml de soluţie (pct. 4.6) şi se agita timp de 30 de minute. Se lasă să se sedimenteze sau se centrifugheaza, apoi se dilueaza soluţia de supernatant cu amestecul (pct. 4.5), pentru a se obţine un conţinut de virginiamicina estimat de 1 f2æg/ml [ = U(8)].6.2. Soluţii de probaDin soluţia U(8) se prepara soluţii U(4) (conţinut estimat: 0,5 f2æg/ml), U 2 (conţinut estimat: 0,25 f2æg/ml) şi U(1) (conţinut estimat: 0,125 f2æg/ml) prin intermediul dilutiei succesive (1+1) cu amestecul (pct. 4.5).7. Procedura de testare7.1. Inocularea mediului de testareSe inoculeaza mediul de testare (pct. 4.1) cu suspensie bacteriana (pct. 3.2) la aproximativ 50°C. Prin teste preliminare pe plăci cu mediu (pct. 4.1) se determina cantitatea de suspensie bacteriana necesară pentru a induce cele mai mari şi mai clare zone de inhibitie, cu concentratii variate de virginiamicina.7.2. Prepararea placilorDifuzia pe agar este efectuată pe plăci cu 4 concentratii ale soluţiei standard [S(8), S(4), S(2) şi S(1)] şi cele patru concentratii ale soluţiei de testare [U(8), U(4), U(2) şi U(1)]. Aceste 4 concentratii de extract şi de standard trebuie neapărat să fie plasate în fiecare placa. În acest scop, se selecteaza plăci destul de mari pentru a permite realizarea a cel puţin 8 godeuri cu diametrul de 10 până la 13 mm şi de cel puţin 30 mm între centre, ce trebuie realizate în mediu de agar. Testul poate fi efectuat pe plăci ce constau din plăci plate de sticlă echipate cu un inel perfectat la nivel, din aluminiu sau plastic, cu diametrul de 200 mm şi înalt de 20 mm.Se toarna în plăci o cantitate de mediu (pct. 4.1), se inoculeaza ca la pct. 7.1, pentru a se obţine o grosime de aproximativ 2 mm (60 ml pentru o placa cu diametrul de 200 mm). Se lasă să se fixeze la o poziţie de nivel, se realizează godeurile şi se plaseaza în acestea volume măsurate cu exactitate de testare şi din soluţii standard (între 0,1 şi 0,15 ml per gaura, în conformitate cu diametrul). Se replica fiecare concentraţie de cel puţin 4 ori, astfel încât fiecare determinare să fie supusă unei evaluări a 32 de zone de inhibitie.7.3. IncubareSe incubeaza plăcile timp de 16 până la 18 ore la 30 ± 2°C.8. EvaluareSe măsoară diametrul zonelor de inhibitie cu o aproximatie de 0,1 mm. Se înregistrează măsurătorile medii pentru fiecare concentraţie pe hârtie grafica semi-logaritmica, relevandu-se logaritmul concentratiilor în legătură cu diametrele zonelor de inhibitie. Se schiteaza liniile cele mai potrivite, atât ale soluţiei standard, cat şi ale extractului. Se determina punctul "cel mai potrivit" pentru nivelul standard cel mai scăzut (SL), utilizându-se formula: 7S(1) + 4S(2) + S(4) – 2S(8) a) SL = –––––––––- 10Se determina punctul "cel mai potrivit" pentru nivelul standard cel mai înalt (SH), utilizându-se formula: 7S(8) + 4S(4) + S(2) – 2S(1) b) SH = –––––––––- 10Se calculează în mod similar punctele "cele mai potrivite" pentru nivelul cel mai scăzut (UL) al extractului şi nivelul cel mai înalt al extractului, inlocuind U(1), U(2), U(4) şi U(8) pentru S(1), S(2), S(4) şi S(8) în formula anterioară.Se înregistrează valorile calculate SL şi SH pe aceeaşi hârtie grafica şi acestea se unesc, pentru a da linia "cea mai potrivita" pentru soluţia standard. Se înregistrează, în mod similar, UL şi UH şi acestea se unesc, pentru a da linia "cea mai potrivita" pentru extract.Liniile trebuie să fie paralele în absenta oricărei interferente. Din motive practice, liniile pot fi considerate paralele, dacă valorile (SH – SL) şi (UH – UL) nu diferă cu mai mult de 10% din valoarea medie a acestora.Dacă liniile sunt estimate a nu fi paralele, fie U(1) şi S(1) sau U(8) şi S(8) pot fi ignorate şi SL, SH, UL şi UH calculate, utilizându-se formula alternativa, pentru a da liniile alternative "cele mai potrivite": 5S(1) + 2S(2) – S(4) 5S(2) + 2S(2) – S(8) a') SL = ––––––– sau SL = ––––––– 6 6 5S(4) + 2S(2) – S(1) 5S(8) + 2S(4) – S(2) b') SH = ––––––– sau SH = ––––––– 6 6şi în mod similar pentru UL şi UH. Trebuie să fie îndeplinite aceleaşi criterii de paralelism. Trebuie să fie notat în raportul final faptul ca rezultatul a fost calculat pornindu-se de la 3 niveluri.Atunci când liniile sunt considerate ca fiind paralele, se calculează logaritmul activităţii relative (log A) prin intermediul uneia dintre următoarele formule, depinzand dacă au fost utilizate 3 sau 4 niveluri pentru evaluarea paralelismului. Pentru 4 niveluri: [U(1) + U(2) + U(4) + U(8) – S(1) – S(2) – S(4) – S(8)] x 0,602 c) Log A = ––––––––––––––––––––– U(4) + U(8) + S(4) + S(8) – U(1) – U(2) – S(1) – S(2) Pentru 3 niveluri: (U 1 +U 2 +U 4 -S 1 -S 2 -S 4 ) x 0,401 d) Log A = ––––––––––––––- U 4 + S 4 – U 1 – S 1 sau [U(2) + U(4) + U(8) – S(2) – S(4) – S(8)] x 0,401 d') Log A = ––––––––––––––––– U(8) + S(8) – U(2) – S(2)Activitatea extractului de proba = activitatea standardului relevant x A[U(8) = S(8) x A]Dacă se constată că activitatea relativă este în afară intervalului 0,5 până la 2,0, atunci se repeta testarea, efectuandu-se ajustarile corespunzătoare la concentratiile extractului sau, dacă acest lucru nu este posibil, la soluţiile standard. Atunci când activitatea relativă nu poate fi adusă în intervalul solicitat, orice rezultat obţinut trebuie să fie considerat ca aproximativ şi acesta trebuie să fie notat în raportul final.Atunci când liniile sunt considerate ca nefiind paralele, se repeta determinarea. Dacă paralelismul nu este încă atins, determinarea trebuie să fie considerată ca nesatisfacatoare.Se exprima rezultatul în miligrame de virginiamicina per kilogram de furaj.9. RepetabilitateDiferenţa dintre rezultatele a doua determinări paralele, efectuate pe aceeaşi proba, de acelaşi analist, trebuie să fie de maximum:– 2 mg/kg, în valoare absolută, pentru un conţinut de virginiamicina de până la 10 mg/kg;– 20% în relaţie cu cea mai mare valoare pentru un conţinut de 10 până la 25 mg/kg;– 5 mg/kg, în valoare absolută, pentru un conţinut de 25 până la 50 mg/kg;– 10% în relaţie cu cea mai mare valoare pentru un conţinut de peste 50 mg/kg.–––
