pentru screeningul biologic al populaţiei în expunerea la plumb
I. Etapa 1: Identificarea şi clasificarea oraşelor şi aglomerărilor din România în care poluarea mediului cu plumb prezintă un risc semnificativ pentru sănătatea populaţiei1. După mărimea localităţii – numărul populaţiei:a) oraşe/aglomerări mai mari de 500.000 de locuitori; … b) oraşe/aglomerări mai mari de 250.000 de locuitori; … c) oraşe/aglomerări mai mici de 250.000 de locuitori; … 2. Identificarea surselor semnificative de poluare cu plumb a mediului de viaţă al localităţilor:a) traficul auto; … b) industriale (metalurgie neferoasă, topitorii, exploatări miniere etc); … c) obiceiuri locale, mici meşteşugari; … d) altele. … 3. Identificarea principalilor factori de mediu afectaţi:a) aer atmosferic; … b) sol; … c) apa potabilă; … d) alimente, altele. … 4. Evaluarea preliminară a expunerii:a) evaluarea datelor de mediu existente cu privire la concentraţiile plumbului în mediile identificate la pct. 3; … b) date din ultimii 5 ani (pe cât posibil). … 5. Identificarea grupelor critice populaţionale cu expunere semnificativă la plumb:a) identificarea numărului, procentului de populaţie expusă, pentru fiecare situaţie; … b) identificarea de grupe populaţionale susceptibile – grupe critice (nou-născuţi, copii cu vârsta cuprinsă între 0-6 ani în special, femei gravide). … II. Etapa a 2-a: Identificarea loturilor populaţionale în vederea screeningului biologic din cadrul oraşelor şi aglomerărilor selecţionate în etapa 1Loturile:1. număr total (cel puţin 100 în oraşele mai mari de 250.000 de locuitori), din care grupuri critice:* nou-născuţi;* copii cu vârsta cuprinsă între 0-6 ani;* femei gravide.2. Se vor investiga persoanele care se oferă voluntar şi care şi-au dat consimţământul în scris pentru a putea fi recoltate probele biologice. De asemenea, se va cere acordul scris pentru a folosi datele din chestionar în conformitate cu prevederile legale în vigoare. În cazul copiilor este nevoie de consimţământul scris al părinţilor.3. Criterii de excludere din lot: expunerea profesională la plumb la locul de muncă.III. Etapa a 3-a: Investigaţiile medicale1. Chestionarul:a) chestionarul de evaluare a condiţiilor de viaţă şi muncă şi de evaluare a stării de sănătate preexistente, elaborat de către Institutul de Sănătate Publică Bucureşti (ISPB), prevăzut la anexa nr. 4 la prezenta metodologie; … b) va fi completat pentru fiecare persoană investigată. … 2. Screeningul populaţional:a) metoda de referinţă – plumbemia: … * metoda de laborator de referinţă – spectrofotometrie de absorbţie atomică – din sânge venos;* metoda alternativă – kituri de testare rapidă, sânge venos sau capilar, de echivalat de către ISPB.b) metode alternative şi/sau adiţionale de screening: determinarea activităţii dehidratazei acidului delta-aminolevulinic – delta-aminolevulinic dehidrataza (ALAD), conform anexelor nr. 1, 2 şi 3 la prezenta metodologie; … c) toate recoltările de probe biologice vor fi însoţite de fişe de identificare; … d) toate recoltările biologice vor fi executate în condiţii de maximă siguranţă şi securitate sanitară, cu respectarea eticii şi deontologiei profesionale, a confidenţialităţii datelor şi cu respectarea normelor de siguranţă şi securitate sanitară în prelevarea probelor. … 3. Posibile evaluări suplimentare:– măsurători somatometrice, tensiune arterială, teste de dezvoltare neuropsihică (WISC – QI, Bender – Santuci, timpul de reacţie auditiv şi vizual)IV. Identificarea laboratoarelor care vor efectua analizarea probelor şi stabilirea programului de asigurarea calităţii:a) identificarea laboratoarelor din cadrul oraşelor şi aglomerărilor identificate în etapa 1, care pot analiza în condiţii optime plumbemia şi/sau ALAD; … b) în cazul în care nu se identifică laboratoare în oraşele şi aglomerările identificate în etapa 1, se trece la identificarea de laboratoare alternative în aşa fel încât să se poată asigura conservarea şi transportarea probelor în condiţii optime; … c) la nivelul ISPB se va asigura controlul de calitate al probelor biologice, plumbemie şi ALAD şi exerciţii de intercomparare între laboratoarele selecţionate. … V. Organizarea de campanii de screening de către autorităţile de sănătate publică judeţene (ASPJ) în colaborare cu ISPBVI. Prelucrarea şi centralizarea datelor din campanie, elaborarea rapoartelor pentru fiecare campanie de către ASPJ în colaborare cu ISPBVII. Transmiterea datelor centralizate către ISPB pentru întocmirea raportului naţional şi înaintarea acestuia către Ministerul Sănătăţii Publice +
Anexa 1––-la metodologie–––––RELAŢIA DOZĂ – EFECTProcentele plumbemiei reţinute pentru evaluarea rezultatelor supravegherii biologice rezultă din analizarea datelor ştiinţifice privind diferitele efecte toxice ale plumbului. Această analiză, care ţine seama de variaţiile normale ale valorilor biologice ale populaţiei, permite stabilirea unor relaţii cvasicantitative între doză şi efect. Următoarele relaţii doză-efect sunt reţinute ca bază de referinţă pentru aplicarea metodologiei:a) o descreştere a activităţii ALAD în globulele roşii, ca urmare a unei expuneri la plumb, atât cât să nu aibă loc o perturbare în hematopoieză, poate fi acceptată pentru populaţie. Pentru plumbemiile mai mici de 15-20 æg/100 ml, se consideră în prezent că descreşterea activităţii ALAD nu produce perturbări în hematopoieză; … b) creşterea protoporfirinelor eritrocitare (PPE) în sânge indică o interferenţă cu utilizarea fierului, inhibând astfel sinteza hemului. Creşterea PPE intervine pentru procentele de plumbemie mai mari de 20-30 æg/100ml. O creştere a PPE se poate datora totuşi şi altor cauze; … c) interferenţa cu sinteza gluthationului nu poate fi tolerată decât la un mic segment al populaţiei şi numai în măsura în care aceasta este slabă şi nu produce alte manifestări subclinice. Această interferenţă inacceptabilă cu sinteza gluthationului nu intervine atunci când valorile plumbemiei sunt sub 30 æg/100 ml; … d) creşterea semnificativă în secreţiile urinare a acidului delta-aminolevulinic (ALAU) este un semn al perturbării importante a metabolismului porfirinelor şi constituie astfel un semn de sănătate deficientă. Creşterea semnificativă din punct de vedere statistic a ALAU nu intervine decât pentru valori ale plumbemiei mai mari de 35 æg/100 ml. … +
Anexa 2––-la metodologie–––––CORESPONDENŢAdintre procentele plumbemiei şi activitatea enzimaticăCorespondenţa dintre procentele plumbemiei şi activitatea enzimatică a ALAD, măsurată după metoda europeană standardizată, conform anexei nr. 3 la metodologie, este următoarea:Plumbemie ALAD(æg/100 ml sânge) (unităţi/litru)35 2030 2520 35Atât timp cât valorile măsurate ale ALAD sunt într-un mod semnificativ superioare limitelor de mai sus pentru diferite segmente de populaţie, nu este necesar să se efectueze noi măsurări ale procentelor de plumbemie în vederea confirmării. +
Anexa 3––-la metodologie–––––PRESCRIPŢII TEHNICEprivind determinarea activităţii ALADMetoda europeană standardizată pentru determinarea activităţii dehidratazei acidului delta-aminolevulinicPrincipiul metodei adoptate pentru determinarea activităţii dehidratazei acidului delta-aminolevulinic este bine cunoscut. El se bazează pe incubaţia enzimei cu un exces de substrat de acid delta-aminolevulinic. Porfobilinogenul format după un timp determinat este amestecat cu reactivul lui Ehrlich modificat şi culoarea obţinută este măsurată cu ajutorul unui fotometru faţă de alb. Cantitatea de porfobilinogen produs indică activitatea ALAD.MetodaEfectul luminiiExperienţele recente au arătat că porfobilinogenul mai ales este foarte sensibil la lumină. Întreaga analiză ar trebui să fie realizată în absenţa oricărei lumini solare directe în laborator (nu numai în locul în care se efectuează analiza).Prima fază – Prelevarea probelor de sânge şi conservarea înaintea analizei:– se ia o probă de sânge de 2 ml sânge venos cu ajutorul unei seringi din plastic (nestabilizată la plumb) în prezenţa heparinei uscate (<5 mg);– se prepară imediat 4 prelevări de 0,2 ml repartizate în tuburi de plastic (nestabilizate la plumb) şi se răcesc la temperatura de 4°C. Pipetarea se efectuează cu pipete gradate de tip Marburg;– dacă analiza se efectuează într-un interval de 3 ore, nu este necesară răcirea probelor;– durata maximă de păstrare a probelor la temperatura de 4°C este de 24 de ore;– chiar înainte de analiză, probele trebuie introduse într-o baie de apă foarte rece timp de 10 minute.Observaţie: Printre materialele plastice cităm polietilena, polistirenul şi polipropilena. Durata păstrării de 24 de ore la temperatura de 4°C rezultă dintr-o estimare prudentă. Acest interval de timp este suficient pentru a permite transportul probei din locul în care s-a făcut prelevarea la un laborator central, în vederea analizei. Dintre cele 4 prelevări de sânge 3 trebuie să fie folosite pentru determinarea ALAD şi una drept probă-martor.A doua fază – Determinarea hematocritului:Această determinare trebuie să fie efectuată:– în acelaşi timp cu proba de sânge;– printr-o metodă capilară folosind două probe.Se centrifughează după închiderea unei extremităţi la o viteză de cel puţin 30.000 de rotaţii pe minut (nu mai puţin de 5 minute).Observaţie: Această determinare trebuie, de preferinţă, să se realizeze pe loc, dar la mai puţin de 24 de ore de la prelevarea probei de sânge. Se utilizează, dacă este posibil, o centrifugă microhematocrită.A treia fază – Hemoliza:– se hemolizează 3 probe de sânge dezgheţate în prealabil cu 1,3 ml apă distilată (adusă în prealabil la temperatura de 37°C) timp de 10 minute la temperatura de 37°C ± 0,2°C;– se adaugă apă, de preferinţă cu ajutorul unei pipete gradate de 2 ml, apoi se amestecă bine;– în acest stadiu probele nu se mai agită.Observaţie: S-a decis folosirea de apă şi nu de Triton X 100 pentru hemoliză. Experienţele de hemoliză cu Triton X 100 conduc la o frânare considerabilă a activităţii ALAD, care nu a putut fi încă explicată şi care ar putea corespunde unui artefact.A patra fază – Adăugarea soluţiei de ALA la hemoliză:– se prepară soluţia de ALA;– ea nu trebuie preparată cu mai mult de 5 ore înainte;– se aduce această soluţie la temperatura de 37°C timp de 10 minute înaintea adăugării;– se adaugă 1 ml din această soluţie hemolizatului, de preferinţă cu ajutorul unei pipete cu bulă de 1 ml, apoi se amestecă.Observaţie: A fost stabilit un pH de 6,4, experienţele demonstrând că la această valoare a pH-ului corespunde cea mai bună corelaţie dintre activităţile ALAD şi procentele plumbemiei pentru populaţiile normale. Nu este vorba de a se obţine un maximum de activitate (realizabil prin ridicarea pH-ului), deoarece activităţile de determinat sunt suficient de importante.A cincea fază – Prepararea martorului:– 0,2 ml de sânge tratat ca pentru determinarea ALAD până în momentul adăugării soluţiei de ALA; în locul acesteia se adaugă 1 ml de soluţie de HgCl2-TCA, apoi 1 ml de soluţie de ALA şi se procedează mai departe la fel ca pentru determinarea ALAD (vezi mai jos);– pentru adăugarea menţionată mai sus se folosesc pipete pentru suflat.Observaţie: Doar un singur martor este comparat cu o serie de 3 încercări pentru fiecare eşantion de sânge. Dacă densitatea optică obţinută pentru martor este prea mare, se va repeta operaţia pentru control.A şasea fază – Incubaţia:– 60 de minute la temperatura de 37°C ± 0,2°C în bain-marie;– timpul de incubaţie porneşte de la adăugarea soluţiei de ALA.Observaţie: Timpul de incubaţie de 60 de minute a fost ales pentru a creşte în mod natural activitatea ALAD, dat fiind că nicio altă fază nu a avut ca efect creşterea artificială a activităţii. Experienţele au arătat că relaţia timp de incubaţie-activitate este liniară pentru intervalele de timp care depăşesc două ore.Temperatura de incubaţie a fost menţinută la temperatura de 37°C din motive practice.A şaptea fază – Oprirea reacţiei PBG:– se adaugă 1 ml de soluţie de HgCl(2)-TCA la amestecul de incubaţie, de preferinţă cu o pipetă de suflat cu bulă de 1 ml.A opta fază – Centrifugarea şi filtrarea:– 30.000 de rotaţii pe minut;– filtrare cu hârtie Whatman nr. 54 sau echivalentă (rezistentă la acid).Observaţie: Centrifugarea trebuie să dureze aproximativ 10 minute.Faza de filtrare a fost introdusă în scopul de a evita pipetarea particulelor mici pe suprafaţa lichidului de deasupra. Se pare că aceste particule produc o reacţie colorată cu reactivul lui Ehrlich. Mai multe încercări au arătat că introducerea fazei de filtrare îmbunătăţeşte reproductibilitatea. La nevoie, faza de filtrare poate fi înlocuită de o a doua centrifugare.A noua fază – Reacţia cu reactivul lui Ehrlich:– se amestecă 1 ml de lichid de deasupra cu 1 ml din reactivul lui Ehrlich modificat, folosind pipete cu bulă;– se amestecă cu ajutorul unui amestecător de tip Vortex pentru a asigura omogenitatea;– se lasă să reacţioneze timp de 5 minute înainte de a măsura extincţia.Observaţie: Pentru a asigura omogenitatea este important să se urmărească amestecarea intimă a lichidului de deasupra cu reactivul lui Ehrlich.A zecea fază – Măsurarea extincţiei:– se etalonează spectrofotometrul cu ajutorul unei soluţii de fenolftaleină într-un tampon alcalin;– măsurarea extincţiei probei în raport cu martorul de 555 nm într-o celulă de 1 cm (sau de 2 cm dacă absorbţia este foarte slabă).A unsprezecea fază – Calculul activităţii enzimatice:– ecuaţia care permite calculul activităţii este următoarea: OD corr. x 35 x 2 x 100 x K ──────────────────────────── =æ moli ALA/mn/ml RBC = U/ml, Hct % x 60 x 62în care:OD – extincţia măsurată;60 – timpul de incubaţie;35 – factorul de diluţie;62 – coeficientul molar al extincţiei în cmc/æmol;K – coeficientul de corecţie spectrofotometrică.Observaţie: Unităţile propuse sunt conforme cu recomandările referitoare la nomenclatorul enzimelor al Uniunii Internaţionale de Biochimie.SOLUŢII1. Prepararea unei soluţii de ALASoluţia A:– 1,78 g de Na(2)HPO(4)-2H(2)O dizolvată în 100 ml de apă distilată (de preferinţă prin deionizareSoluţia B:– 1,38 g de NaH(2)PO(4)-1H(2)O dizolvată în 100 ml de apă distilată;– 29 ml de soluţie A + 71 ml de soluţie B dau un tampon de 0,1 M de fosfat de Na la pH 6,4.Această forţă ionică a tamponului este necesară pentru a împiedica orice variaţie a pH-ului în soluţia de reacţie;– 167,6 mg de ALA-HCl sunt dizolvate în soluţia B (aceasta fiind mereu acidă); pH-ul este ajustat la 6,4 cu ajutorul soluţiei A. Volumul este apoi adus la 100 ml cu soluţia tampon de 0,1 M fosfat de Na la pH 6,4. Această preparare dă o soluţie de 0,01 M de ALA.2. Soluţia de HgCl(2)-TCA:– 1,35 g de HgCl(2) sunt dizolvate în 100 ml de acid tricloracetic 10%.3. Soluţia de reactiv al lui EhrlichReactivi:– 2,5 g de dietilaminobenzaldehidă (pDMAB);– 0,25 g de HgCl(2) dizolvate în 10 ml de acid acetic glacial;– acid percloric cu masa specifică de 1,7;– acid acetic glacial.Preparare:Se dizolvă pDMAB în 50 ml de acid acetic glacial, se adaugă 24,5 ml de acid percloric şi 4 ml de HgCl(2). Se amestecă, se răceşte şi se aduce la 100 ml cu acid acetic glacial într-un balon cotat*1). Se păstrează într-un flacon de culoare închisă.––––*1) Dacă în această fază apare o culoare brună, reactivul trebuie aruncat. +
Anexa 4––-la metodologie–––––ID ……………JUDEŢUL ………..LOCALITATEA …….Instrucţiuni de completare a chestionarului:Acest chestionar cuprinde întrebări referitoare la persoana examinată (anumite întrebări se referă cu precădere la copiii investigaţi), caracteristicile locuinţei, traficului din zona rezidenţială. Vă rugăm să completaţi în întregime chestionarul, iar în cazul copiilor este de preferat să se completeze de către mama copilului.La majoritatea întrebărilor se va răspunde prin bifarea/încercuirea răspunsului corect sau prin scrierea pe o linie punctată.Numele şi prenumele …………………………………..Vârsta ……… ani Sexul: masculin/femininAdresa: localitatea ……………, codul poştal ………….,sectorul ………….., str. ………… nr. ……………..Număr de telefon de contact …………………………….. .A. ÎNTREBĂRI GENERALEA1. Locul şi data naşterii:Localitatea ……., judeţul ……., ziua …, luna …, anul ….A2. De cine este completat chestionarul (în cazul copiilor):1. mamă2. tată3. bunici4. alţiiA3. Data completării chestionarului:Ziua ………. luna ……… anul …………..A4. De cât timp locuiţi la adresa din prezent?1. mai puţin de 3 ani2. peste 3 ani3. de la naştereA5. De cât timp locuiţi la prezenta adresă?1. dinaintea sarcinii cu acest copil2. după naşterea acestui copilB. ÎNTREBĂRI REFERITOARE LA LOCUINŢĂ ŞI LOCATARIB1. Când a fost construită locuinţa dumneavoastră?1. cu mai mult de 50 de ani în urmă2. între 50-10 ani în urmă3. cu mai puţin de 10 ani în urmăB2. Pe ce tip de stradă este situată locuinţa dumneavoastră? (bifaţi o variantă)1. stradă laterală de cartier2. stradă principală de cartier3. arteră principală a oraşului/localităţii4. drum regional5. autostradăB3. Ce tip de autovehicule circulă în zona dumneavoastră rezidenţială? (bifaţi toate variantele)1. autoturisme2. autobuze3. alte mijloace de transport în comun, specificaţi …………..4. camioane, maşini mari5. toate tipurileB4. Cum apreciaţi intensitatea traficului pe strada pe care locuiţi? (bifaţi o variantă)1. foarte intens ziua2. intensitate medie3. intensitate moderată4. intensitate redusăB5. Cum este amplasată locuinţa în care locuiţi?1. despărţită de stradă prin spaţiu verde2. despărţită de stradă prin alt spaţiu (de exemplu, teren viran)3. la stradăB6. Menţionaţi dacă se curăţă de praf/se spală strada pe care locuiţi:DA/NUB7. Câte camere de locuit are locuinţa dumneavoastră? …….. camereB8. Câte persoane stau permanent în locuinţă? ……….. persoaneB9. În cazul copiilor, cu cine locuieşte copilul în cameră?1. singur2. cu o persoană3. cu mai multe persoaneB10. Unde este amplasată camera în care vă petreceţi cea mai mare parte a timpului?1. spre curte/spaţiu verde2. spre stradă/traficB11. Cât de des aerisiţi camera în care vă petreceţi cea mai mare parte a timpului?1. zilnic2. săptămânal3. mai rarB12. Când obişnuiţi să aerisiţi camera?1. dimineaţa2. la prânz3. după-amiază/searaB13. Obişnuiţi să aspiraţi praful din locuinţă?1. zilnic2. săptămânal3. lunar4. mai rarB14. Obişnuiţi să ştergeţi praful cu o cârpă udă?1. zilnic2. săptămânal3. lunar4. mai rarB15. În cazul copiilor, cât timp petrece copilul la joacă în faţa casei?1. mai puţin de două ore2. între două şi 4 ore3. între 4 şi 6 ore4. peste 6 oreB16. În cazul copiilor, unde obişnuieşte să se joace copilul?1. în zone special amenajate2. în zone cu spaţiu verde3. în zone virane4. în apropierea zonelor cu trafic intensB17. Obişnuieşte copilul să se joace cu nisip/pământ, în sezonul de primăvară/vară/toamnă?DA/NUB18. Specificaţi dacă copilul îşi petrece o parte din timp în următoarele condiţii:a) pe timpul creşei/grădiniţei/şcolii, la bunici sau în altă parte: DA/NU … b) pe timpul vacanţelor, la bunici sau în altă parte: DA/NU … B19. Există în locuinţă persoane care lucrează în mediu profesional cu expunere crescută la plumb?B20. Cine sunt aceste persoane?1. mama2. tata3. bunicii4. alţiiB21. Sunt asigurate la locul de muncă şi folosite următoarele:1. schimbarea hainelor la sfârşitul zilei de muncă2. duşul la sfârşitul zilei de muncă3. nu se practică aceste măsuriB22. Există în locuinţă persoane care au lucrat sau lucrează în mediu profesional cu expunere crescută la plumb?DA/NUB23. Cine ………………………………………………În ce perioadă? De la data de …………. până la …………B24. În cazul utilizării de legume şi fructe, spălaţi bine aceste produse înainte de consum?DA/NUB25. Cultivaţi legume, fructe în propria gospodărie?DA/NUB26. Unde cultivaţi legume, fructe?1. departe de zone de trafic2. în vecinătatea unor zone de trafic3. în apropierea unor zone industriale de metalurgie neferoasăB27. Obişnuiţi să creşteţi animale în propria gospodărie?DA/NUB28. Unde creşteţi animale?1. departe de zonele de trafic2. în vecinătatea unor zone de trafic3. în apropierea unor zone industriale de metalurgie neferoasăB29. Vă spălaţi pe mâini ori de câte ori intraţi în casă şi înainte de fiecare masă (mai ales în cazul copiilor?DA/NUB30. Obişnuieşte copilul să ducă jucării murdare la gură (jucării căzute pe jos şi nespălate)?DA/NUC. ÎNTREBĂRI DESPRE STAREA DE SĂNĂTATE A PERSOANEI INVESTIGATE/A COPILULUI INVESTIGATC1. În cazul copiilor, vi s-a comunicat vreodată de un medic că dezvoltarea fizică a copilului este deficitară?DA/NUC2. Aţi fost diagnosticat vreodată (persoana investigată sau copilul chestionat) de către medic cu:a) anemie DA/NU … b) lipsă de calciu DA/NU … c) deficit proteic DA/NU … C3. Vi s-a comunicat vreodată de către educatoarea/profesorul copilului că acesta ar fi prezentat:a) iritabilitate, irascibilitate marcată DA/NU … b) performanţă intelectuală mai redusă DA/NU … c) tulburări de comportament DA/NU … D. FACTORI EDUCAŢIONALI ŞI SITUAŢIA SOCIOECONOMICĂD1. Ce pregătire şcolară are mama copilului sau persoana de sex feminin cu care locuieşte copilul?1. primară (clasele I-VIII)2. şcoală profesională/tehnică3. postliceală4. liceu5. superioară (universitate)D2. Ce pregătire şcolară are tatăl copilului sau persoana de sex masculin cu care locuieşte copilul?1. primară (clasele I-VIII)2. şcoală profesională/tehnică3. postliceală4. liceu5. superioară (universitate)D3. Ce profesie are mama copilului sau persoana de sex feminin cu care locuieşte copilul?1. muncitor agricol2. muncitor necalificat3. muncitor semicalificat4. muncitor calificat5. tehnician6. funcţionar7. administrator8. specialist, funcţionar superiorD4. Ce profesie are tatăl copilului sau persoana de sex masculin cu care locuieşte copilul?1. muncitor agricol2. muncitor necalificat3. muncitor semicalificat4. muncitor calificat5. tehnician6. funcţionar7. administrator8. specialist, funcţionar superiorE. ÎNTREBĂRI REFERITOARE LA CREŞĂ/GRĂDINIŢĂ/ŞCOALĂE1. De cât timp frecventează copilul creşa/grădiniţa sau şcoala prezentă:De ……. ani ……… luniVă mulţumim pentru colaborare.––––-
