la Ordinul nr. 89/2003*), privind stabilirea condiţiilor în care anumite organisme dăunătoare, plante, produse vegetale sau articole reglementate, prevăzute în anexele nr. 1-5 la Normele metodologice de aplicare a Ordonanţei Guvernului nr. 136/2000, aprobate prin Hotărârea Guvernului nr. 1.030/2001, pot fi introduse sau puse în circulaţie pe teritoriul României ori în zonele protejate din România, pentru experienţe, scopuri ştiinţifice sau experimentale şi lucrări pe selecţii varietale

ANEXANr.1

1. 1. In baza articolului 1 al prezentului Ordin se aplica urmatoarele conditii generale:

   • – natura si obiectivele activitatilor pentru care este introdus sau deplasat materialul trebuie sa fie examinate de catre organismul oficial responsabil si gasite in conformitate cu conceptul de experienta, scop stiintific, sau experimental si lucr ri pe selectii varietale prevazute in Hotararea de Guvern numarul 1030/2001 privind masurile de protectie împotriva introducerii si raspandirii organismelor de carantina daunatoare plantelor sau produselor vegetale in Romania;

   • – Conditiile de carantina a unitatilor si instalaţiilor de la locul sau locurile in care se desfasoara activitatile sunt inspectate de catre organismul oficial responsabil pentru a fi in conformitate cu prevederile de la punctul 2,

   • – Organismul oficial responsabil limiteaza cantitatea de 1naterial importat la un nivel corespunzaror activitatilor aprobate, fara a se depasi capacitatea instalatiilor de carantina disponibile)’

   • – Calificarea stiintifica si tehnica a personalului prin care se desfaroara activitatile” trebuie sa fie verificata si aprobata de catre organismul oficial responsabil.

2. 2. In baza punctului 1, conditiile de carantina a unitatilor s1 instalatiilor de la locul sau locurile de desfasurare a activitatilor trebuie sa fie suficiente pentru a asigura manipularea în siguranta a n1aterialului, astfel incat sa fie eliminat riscul raspandirii organismelor daunatoare.

Pentru fiecare activitate specificata in cerere, organismul oficial responsabil determina riscul raspandirii organismelor daunatoare tinute in conditii de carantina, tinand cont de natura materialului si de activitatea-avuta-în vedere, de biologia organismului daunator, de mijloacele de raspandire, de interactiunea cu mediul si de ceilalti factori relevanti legati de riscul prezentat de material.

1. A. Ca rezultat al evaluarii riscului, organismul oficial responsabil ia in calcul si stabileste, dupa caz, unnatoarele masuri de carantina privind unitatile, instalatiile si procedurile de lucru:

   1. a) izolarea fizica a organismelor daunatoare de orice alt material, inclusiv controlul vegetatiei din zonele inconjuratoare;

   2. b) desemnarea unei persoane de contact responsabila cu activitatile;

   3. c) accesul limitat in unitati si instalatii precum si in zona inconjuratoare, dupa caz, numai pentru personalul numitJ

   4. d) identificarea unitatilor si instalatiilor corespunzatoare, indicand tipul activitatilor si personalul autorizat,’

   5. e) pastrarea unui registru al activitatilor desfasurate si a unui manual cu procedurile de operare, incluzand procedurile in cazul scaparii organismelor daunatoare din carantina;

   6. f) sisteme adecvate de securitate si alarma;

   7. g) masuri de control adecvate pentru prevenirea introducerii si a raspandirii organismelor daunatoare in unitati,

   8. h) proceduri de control pentru esantionarea si transferul materialului intre unitati si instalatii;

   9. i) controlul eliminarii deseurilor, solului si apei;dupa caz;

   10. j) proceduri si instalatii adecvate de igiena si dezinfectie pentru personal, unitati si echipament;

   11. k) masuri si instalatii adecvate pentru eliminarea riscului prezentat de materialul experimental;

       1. 1) proc·eduri si instalatii de indexare adecvate (incluzand testarea) si

2. B. Masuri de carantina suplimentare conforme cu biologia specifica si epidemiologia tipului de material implicat in activitatile aprobate:

   1. a) pastrarea in instalatii, in camere speciale, unde accesul personalului se face prin usi duble;

   2. b) pastrarea in spatii cu presiune negativa;

   3. c) izolarea in containere prevazute cu pereti din plasa, cu ochiuri de dimensiuni corespunzatoare si alte bariere, de exemplu baraje lichide pentru acarieni, containere cu sol pentru nematozi, capcane electrice pentru insecte;

   4. d) pastrarea in conditii de izolare de alte organisme daunatoare si de alte materiale infestate, de exemplu: substratul in care au crescut plantele atacate, plantele gazda atacate;

   5. e) pastrarea materialului pentn1 inmultire in custi de inmultire cu mecanisme de manipulare;

   6. f) evitarea incrucisarii organismelor daunatoare cu tulpini sau specii indigene;

   7. g) evitarea cresterii permanente a organismelor daunatoare,’

   8. h) pastrarea in conditii prin care se controleaza strict multiplicarea organismelor daunatoare, de exemplu într-un mediu de inhibare a diapauzei,

   9. i) pastrarea in asa fel incat sa nu aiba loc raspandirea pnn n1ijloace de propagare’.) de exemplu, evitarea curentilor de aer

   10. j) proceduri de verificare a puritatii culturilor de organisme daunatoare pentru a le pastra libere de paraziti si alte organisme daunatoare,L

   11. k) program adecvat de control al materialului pentn1 a elimina posibilii vectori:

       I) pentru activitatile in vitro,manevrarea materialului in conditii sterile: echiparea laboratorului pentru executarea procedurilor 1n conditii aseptice/

       1. m) pastrarea organismelor, care se raspandesc prin vectori, in conditii care sa previna raspandirea prin intermediul vectorilor, de exemplu folosirea de plase cu ochiuri de dimensiuni controlate, izolarea solului

       2. n) izolarea în functie de sezonJ astfel incat activitatile sa fie efectuate in perioadele cu risc fitosanitar scazut.

       ROMANI.A

       §ClU§OARE DE AUTORIZARE JLJETTER OF AUTHORITY

       1. Numele şi adresa expeditorului/ Organizatia de protectia plantelor din tara de origine Name and address of the consignor/ Plant protection organization ofthe country of origin	§cirnimă!lll"l!l ttlle ă!ll!Rtorn7llllll"l!l JP'enntru filllltll"ottllllllcewean şi/smun llJlll!llD.illll”l!lă!l nJIB cii!l”clll!Ilă!lţie ă!l orglllllllB!i!lllBl!llloll” diiilllll!Riiiltoiure, pllmnntelloll”, pwo«!lMsellow vegetl!llle !iă!lllil ă11rlk0Beloll” iregDemmeJIB1tl!l1te pei!ll1tnn iei.perieJID.1te, scopuri ştninţilf’ke Slll111l upewimmeDl!ta!Be şii pei!ll1tll"IIH IWicll”inri pe selec ni vă!lri.e1tă!llle !Le11:11:ew olt' l!lllllttllnoll"âfy !Foir 1tllne iinnttirottll11Hdn®D11 lllnn«ll/ow mmovemmellll1t olt'11:ni!llrmmlt'lll!Il oirgallllii!imms, JP1IlH1ts, JPilă!ll!l.1t pir@dllllcts ă!lllllirll 01tllne1r olojects foir 1t!l”ălllll llllir sde1111tnll'k ]PnRlrjpl®§(!l§ Hilll foir woirlk ®Hll VlllllllrHl!l1tail seilednlOillll§
       2. Numele şi adresa persoanei competente pentru activităţile aprobate/ Name and address of the person responsible for the aapproved aactivities :
       	3. Numele organului oficial competent / Name of the responsible official body :
       4. Adresa şi descrierea locului sau locurilor specifice pentru detinerea în carantină/ Address and description of the specific site or sites for quarantine containement :	5. Locul de origine (dovada documentară anexată pentru materialele originare dintr-o alta ţară)/ Place of origin (documentary evidence attached for material originating in a third country ) :
       	6. Numărul de paşaport al plantei!Plant passport number: sau/or Numărul certificatului fitosanitar/ Phytosanitary certificate number :
       7. Punctul de intrare declarat pentru materialul introdus dintr-o alta ţară/ Declared point of entry for material introduced from a third country :
       8. Denumirea(ile) ştiinţifică(e) a(le) materialului, inclusiv organismele dăunătoare respective/ Scientific name(s) of the materii, including the harmful orgaanisms concerned:		9. Cantitatea de material/ Quantity of mterial:
       10. Tipul de material/Type of material :
       11. Declaraţia suplimentară/ Additional declaration : Acest material este introdus I pus în circulaţie în1 Romania , conform legislatiei în vigoare/ This material is introduced into/ moved within 1 Romania, under the applicable law
       12. Informaţii suplimentare/ Additional information :
       13. Avizarea materialului de către organismul oficial responsabil din locul de origine/ Endorsement by the responsible official body in the place of origin Locul avizării/ Place of endorsement: Data/Date: Numele şi semnătura funcţionarului autorizat/ Name and signature of authorized officer:	14. Ştampila organismului oficial responsabil emitent/ Stamp ofthe responsible official body ofissue: Locul eliberării/ Place of issue: Data/ Date: Numele şi semnătura funcţionarului autorizat/ Name and signature of authorized officer:

       NB: Rubricile sau zonele colorate in gri nu se completeaza/The requirements in gray are not applicable

       

       1 Se taie unde nu este aplicabil/ Delete if not applicable

       ANEXANr.3

       RO.MANIA §Cfil§OARJE DE AUTOW:Z.ARE lLETTER OF AUTHOfilTY

       1. Numele şi adresa expeditorului/Organizaatiaa de protectia plaantelor din taaraa de origine Name and address of the consignor/ Plant protection organizaation ofthe country of origin :	§cirliso!llirie idlie ă!ll11!11:oiri.7l!llire lP'ellll1tll"lll i.llll11:ll"Olidllll!ceireai şi!Sl!lllll JP>lllllllllell"le!ll ÎI!ll dirclll!Ilaiţie ăl) oJrgainnns!lllllefoir idliiillll111.ătoaiirie, pilaillil11:elloJr, piroidll!llseBoiir nge11:aJJile s!llun !llll1ftcoiBefon- iregDennnel!ll11:ai11:e JP>iellll11:Im ie:1.1:JP>ieiriel!Il1te, sco[l)l!l!Iri. ştJiiinnţRfficie sH e:1.1:peiri.nnneml!lllle şi. fPll!l!IIl11:Irl!llIllll!ciriiiri. JPll!l sel.ecţi.i. vaiirfiet2Ile !Let11:eir o1FH1l:lbmiri.fy JFoiir 11:llne i.!lll1tll"Oidllllldiiol!Il lllllllidllIl!1ll!Il1ts, ]Plftai!lllt JP>ll°®idll!llds ai111.idl 011:llneir objeds foir 11:iriall oir sdellll1l:illnc ]Pll!llll’l!)>Oses !1ll!Il«ll foir woirlk OI!ll v!llirid!llll selliediiol!lls
       2. Numele şi adresa persoanei competente pentru activităţile aprobate/ Name and address of the person responsible for the aapproved aactivities :
       	3. Numele organului oficial competent I Name of the responsible official body
       4. Adresa şi descrierea locului sau locurilor specifice pentru detinerea în carantină/ Address and description of the specific site or sites for quarantine containement :	5. Locul de origine (dovada documentară anexată pentru materialele originare dintr-o alta ţară)/Place of origin (documentary evidence attached for material originating in a third country ) :
       	6. Numărul de paşaport al plantei/Plant passport number: sau/or Numărul certificatului fitosanitar/ Phytosanitary certificate number :
       7. Punctul de . intrare declarat pentru materialul introdus dintr-o alta ţară/ Declared point of entry for material introduced from a third country :
       8. Denumirea(ile) ştiinţifică(e) a(le) materialului, inclusiv organismele dăunătoare respective/ Scientific name(s) of the materii, including the harmful orgaanisms concemed:		9. Cantitatea de material/ Quantity of mterial :
       10. Tipul de material/Type of material:
       11. Declaraţia suplimentară/ Additional declaaration : Acest material este introdus/ pus în circulaţie în1 Romania, conform legislatiei in vigoare/ This material is introduced into/ moved within IRomania, under the applicable law
       12. Informaţii suplimentare/ Additional information:
       13. Avizarea materialului de către organismul oficial responsabil din tara de origine/ Endorsement by the responsible official body in the country of origin Locul avizării/ Place of endorsement: Data/Date: Numele şi semnătura funcţionarului autorizat/ Name and signature of authorized officer:	14. Ştampila organismului oficial responsabil emitent/ Stamp ofthe responsible official body ofissue: Locul eliberării/ Place of issue: Data/Date: Numele şi semnătura funcţionarului autorizat/ Name and signature of authorized officer:

       NB: Rubricile sau zonele colorate in gri nu se completeaza/The requirements in gray are not applicable

       

       1Se taie unde nu este aplicabil/ Delete if not applicable

       MĂSURI DE CARANTINĂ, INCLUSIV TESTAREA MATERIALULUI DESTINAT SCOATERII DIN CARANTINĂ

       PARTEA A

       Pentru anumite materiale enumerate în Anexa 3 a Hotărârii Guvernului nr. 1030/2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România.

       Secţiunea 1: Plante de Citrus L, Fortunella Swingle, Poncirus Raf şi hibrizii acestora, altele decât fructele şi seminţele

       1. 1. Materialul, după caz, se supune procedurilor adecvate de terapie prevăzute în Ghidul tehnic FAO/IPGRI.

       2. 2. Materialul , urmând procedurile de terapie n1entionate la punctul 1, este indexat.

          Întregul material, inclusiv plantele pentru indexare, se păstrează

          în instalaţiile aprobate, în condiţiile de izolare în carantină, mentionate în Anexa 1.

          '

          Materialul destinat aprobării pentru scoaterea din carantina se păstrează în condiţii care să permită un ciclu normal de vegetaţie şi se supune inspecţiei vizuale, la sosire şi ulterior, la momente potrivite, pe durata indexarii, in vederea identificarii semnelor şi simptomelor produse de organisme dăunătoare, inclusiv de toate

          organismele dăunătoare relevante enumerate în Hotărârea

          – '

          Guvernului numarul 1030/2001 privind măsurile de protecţie

          împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România.

       3. 3. Confonn punctului 2, materialul identificat) pentru organisme următoarelor proceduri:

          este indexat (testat şi dăunătoare, respectand

          1. 3.1. Testarea este efectuata prin metode adecvate de laborator şi când este cazul; plante indicator, inclusiv Citrus sinensis (L.) Osbeck, C. aurantifolia Christm. Swing, C. medica L., C. reticulata Blanco şi Sesamum L., pentru a detecta cel puţin următoarele organisme dăunătoare:

             1. a) Citrus greening bacterium

             2. b) Citrus variegated chlorosis

             3. c) Citrus mosaic virus

             4. d) Citrus tristeza virus (toate izolatele)

             5. e) Citrus vein enation woody gall

                t) Leprosis

                1. g) Naturally spreading psorosis

                2. h) Phoma tracheiphila (Petri) Kanchaveli Gikashvili

                3. i) Satsuma dwarf virus

                4. j) Spiroplasma citri Saglio et al

                5. k) Tatter leaf virus

                i) Witches broom (MLO)

                m) Xanthomonas campestris (toate tulpinile patogene la Citrus)

          2. 3.2. Pentru boli precum „Blight and blight Iike”, pentru care nu se poate face indexarea rapida, materialul trebuie supus, la sosire, testării prin grefarea mugurelui terminal pe un portaltoi crescut în cultură sterilă, conform cu Ghidul tehnic al FAO/IPGRI, iar plantele rezultate se supun procedurilor de terapie prevăzute la pct. 1.

       4. 4. Materialul supus inspecţiioIr vizuale la care se referă punctul 2 şi la care s-au observat semnele şi simptomele produse de organismele dăunătoare este supus unei investigaţii incluzând testarea, când ste cazut pentru identificarea cât mai rapidă a organismelor _dăunătoare care au cauzat semnele şi simptomele respective.

       Secţiunea 2 : Plantele de Cydonia Mill, Malus Mill, Prunus L. şi Pyrus L. şi hibrizii acestora şi Fragaria L., destinate plantării, altele decât seminţele

       1. 1. Materialul se supune, dupa caz, procedurilor adecvate de terapie prevăzute în Ghidul tehnic al FAO/IPGRI.

       2. 2. Materialul, urmând procedurile de terapie prevăzute la punctul I, se supune procedurilor de indexare în totalitatea sa.

          Întregul material, inclusiv plantele pentru indexare, se păstrează în instalaţii, în condiţiile de carantină mentionate la Anexa 1.

          Materialul care trebuie aprobat pentru scoaterea din carantina se. păstrează în condiţii favorabile aparitiei semnelor şi simptomelor de organisme dăunătoare, inclusiv toate organismele dăunătoare relevante listate în Hotărârea Guvernului numarul 1030/2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România, la sosire şi ulterior, la momentele potrivite, în timpul procedurilor de indexare.

          1. 3.1. Conform punctului 2, materialul se indexează pentru depistarea organismelor dăunătoare (testare şi identificare), după următoarele proceduri:

          2. 3.2. Pentru Fragraria L., indiferent de ţara de ong1ne a materialului, pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator şi, când este cazul, plante indicator, inclusiv Fragraria vesca, F virginiana şi Chenopodium spp. pentru a detecta cel puţin următoarele organisme dăunătoare:

             1. a) Arabis mosaic virus

             2. b) Raspberry ringspot virus

             3. c) Strawberry crinkle virus

             4. d) Strawberry latent „C” virus

             5. e) Strawberry latent ringspot virus

             6. f) Strawberry mild yellow edge virus

             7. g) Strawberry vein banding virus

             8. h) Strawberry witches’ broom MLO

             9. i) Tomato black ring virus

             10. j) Tomato ringspot virus

             11. k) Colletotrichum acutatum Simmonds

                 I) Phytophthora fragariae Hickman var. fragariae Wilcox Duncan

                 (m)Xanthomonas fragariae Kennedy King

                 1. 3.2.1. În cazul Malus Mill: când materialul provine.dintr-o ţară care nu este cunoscuta a fi libera de unul din următoarele organisme dăunătoare:

                    1. a) Apple proliferation mycoplasm; sau

                    2. b) Cherry rasp leaf virus (American),

                       pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator şi, când este cazul , plante indicator pentru detectarea organismelor dăunătoare relevante şi,

                 2. 3.2.2. Indiferent de ţara de origine a materialului, pentru testare se folosec metode adecvate de laborator şi, când este cazul, plante indicator pentru detectarea a cel puţin următoarelor organisme dăunătoare:

                    1. a) Tobacco ringspot virus

                    2. b) Ton1ato ringspot virus

                    3. c) Erwinia amylovora (Burr.) Winsl. Et al.

          3. 3.3. Pentru Prunus L., după caz, pentru fiecare specie de Prunus:

             1. (1) Când materialul este originar dintr-o ţară care nu este cunoscuta a fi libera de oricare din următoarele organisme dăunătoare:

                1. a) Apricot chlorotic leafroll mycoplasm;

                2. b) Cherry rasp leafvirus (American); sau

                3. c) Pseudomonas syringae pv. persicae (Prunier et al.) Young

                   etal,

                   pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator şi, când este cazul, plante indicator pentru detectarea organismelor dăunătoare relevante şi

             2. (2) Indiferent de ţara de origine a materialului,pentru testare se folosec metode adecvate de laborator şi, când e te cazul, plante indicator pentru a detecta cel puţin următoarele organisme dăunătoare:

                1. a) Little cherry pathogen (izolate non-Europene)

                2. b) Peach mosaic virus (American)

                3. c) Peach phony rickettsia

                4. d) Peach rosette mosaic virus

                5. e) Peach rosette mycoplasm

                6. f) Peach X disease mycoplasm

                7. g) Peach yellows mycoplasm

                8. h) Plum line pattern virus (American)

                9. i) Plum pox virus

                10. j) Tomato ringspot virus

                11. k) Xanthomonas camperesis pv. pruni (Smith) Dye.

          4. 3.4. În cazul Cydonia Mill şi·Pyrus L.,·indiferent de ţara de origine a 1naterialului,pentru testare se folosesc metode adecvaJe de laborator, şi, când este cazul, plante indicator, pentru a detecta cel puţin următoarele organisme dăunătoare:

             1. a) Erwinia an1ylovora (Burr.) Winsl. Et al.

             2. b) Pear decline mycoplasm

          4. Materialul supus inspecţiilor vizuale mentionate la punctul 2 şi la care s-au observat semne şi simptome produse de organismele dăunătoare, se supune unei investigaţii, incluzând testarea când este cazul, pentru identificarea organismelor dăunătoare ce au cauzat semnele şi simptomele respective.

          Sect.iunea 3: Plantele de Vitis L., altele decât fructele

          1. Materialul se supune, după caz, procedurii adecvate de terapie, prevăzute în Ghidul tehnic al FAO/IPGRI.

          1. 2 (1) Materialul, urmând procedurile de terapie mentionate la punctul I, se supune procedurilor de indexare in totalitatea sa.

             1. (2) Întregul material, inclusiv plantele pentru indexare, se păstrează în instalaţiile aprobate, în condiţiile de carantină specificate în Anexa 1.

             2. (3) Materialul destinat aprobării pentru scoaterea din carantina se păstrează în condiţii care să permită un ciclu vegetativ normal şi va fi supus inspecţiei vizuale efectuate la sosire şi ulterior, la momente potrivite, în timpul perioadei procedurilor de indexare, pentru detectarea semnelor şi simptomelor produse de organismele dăunătoare, inclusiv cele cauzate de Daktulosphaira vitifoliae (Fitch) şi ale tuturor celorlalte organisme dăunătoare relevante listate în Hotărârea Guvernului numarul 1030/2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România.

                Conform punctului 2, materialul se indexeaza pentru testarea şi depistarea organismelor dăunătoare (testat şi identificat) în conformitate cu următoarele proceduri:

       3. 3. Pentru materialul care provine dintr-o ţară care nu este cunoscută ca fiind liberă de următoarele organisme dăunătoare:

          1. a) Boala Ajinas ika.Pentru testare se foloseste o metodă adecvată de laborator iar, în cazul unui rezultat negativ, materialul vegetal va fi altoit pe soiul Koshu şi ţinut sub observaţie cel puţin două cicluri de vegetaţie.

          2. b) Grapevine stunt virus. Pentru testare se folosesc plante indicator adecvate, inclusiv soiul Campbell Early; jar observaţiile se fac timp de un an.

          3. c) Summer mottle. Pentru testare se folosesc plante indicator adecvate, inclusiv soiurile Sideritis, Cabernet-Franc şi Mission.

          Indiferent de ţara de origine a materialului, pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator şi, când este cazul, plante indicator pentru detectarea cel puţin următoarele organisme dăunătoare:

          1. (a) Blueberry leaf mottle virus

          2. (b) Grapevine flavescence doree MLO si altele (Grapevine yellows)

          3. (c) Peach rosette mosaic virus

          4. (d) Tobacco ringspot virus

          5. (e) Tomato ringspot virus (suşa "yellow vein”şi alte suşe)

          6. (f) Xylellafastidiosa (Well Raju)

          7. (g) Xylophilus ampelinus (Panagopoulos) Willems et al.

       4. 4. Materialul supus inspecţiei vizuale prevăzuta la punctul 2 şi pe care au fost observate semne şi simptome de organisme dăunătoare se supune unei investigaţii care să includă testarea, unde este necesar, pentru a determina cât mai rapid posibil identitatea organismelor dăunătoare care cauzează semnele şi simptomele.

          Sectiunea 4 : Plante ale speciei Solanum L . care formeaza stoloni sau tuberculi sau hibrizii lor, destinate plantarii

          1. 1. Materialul, dupa caz, se supune procedurilor de tratament prevăzute in Ghidul Tehnic FAO/IPGRI.

             2(1) Se indexeaza fiecare unitate a materialului, urmând procedurile de tratament prevăzute la punctul 1.

             1. (2) Întregul material, inclusiv plantele pentru indexare, se pastreaza in instalatiile aprobate, t în condiţiile de carantină prevăzute in Anexa 1.

             2. (3) Materialul destinat scoaterii din carantina se pastreaza in conditii care sa permita un ciclu normal de crestere vegetativa si se inspecteaza vizual pentru semne si simptome produse de organismele daunatoare, inclusiv de toate organismele daunatoare relevante listate in Hotărârea Guvernului numarul l 030/2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organisn1elor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România si Potato yellow vein disease, la sosire si ulterior, la intervale regulate, până la sfarsitul ciclului vegetativ, pe toata perioada procedurilor de indexare.

             1. 3 Procedurile de indexare mentionate la punctul 2 urmeaza prevederile tehnice de la punctul 5, pentru a detecta cel putin urmatoarele organisme dăunătoare:

             A- Bacterii

             1. a) Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al ssp. Sepedonicus (Spieckermann et Kotthoft) Davis et al;

             2. b) Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, cunoscuta si sub numele de Ralstonia solanacearum (Smith) Smith

                

             3. c) Testarea tuberculilor nou formaţi, sau a bazei tulpinii, pentru speciile care nu formează tuberculi, este recomandată pentru un ciclu normal de creştere vegetativă care urmează testării menţionate la punctul a si b.

             4. d) Pentru materialul menţionat la punctul a, in vederea testarii metoda de testare pentru Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) David et al. se foloseste metoda descrisa in sectiunea 5 a prezentei Anexe. Pentru materialul menţionat la punctul b, poate fi aplicată aceasi metodă de testare.

             5. e) Pentru materialul mentionat la punctul a, în vederea testârii pentru Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, Ralstonia solanacearum (Smith) Smith, se aplica metodele aprobate prin Ordin al Ministrului " Agriculturi, Alitnentatiei si Padurilor.

             8- Virusuri si organisme analoage virusurilor, altele decat Potato spindle tuber viroid.

             1. a) Testarea minimă pentru tuberculi, plante tinere si butaşi, incluzând micro-plante, include un test serologic făcut la sau aproape de înflorire pentru fiecare din organismele dăunatoare listate, altele decât Potato spindle tuber viroid, urmat de un test biologic al materialului gasit negativ la testul serologic.

             2. b) Pentru Potato leaf roll virus, se fac două teste serologice.

             3. c) Testarea miriimă pentru să1nânţa de cartof consta intr-un test s_erologic .sau bi logic, dacă nu este disponibil unul serologic. Pentru• probele gasite negative se recomanda retestarea unei parţi din probe; pentru rezultatele incerte, se face testarea materialului prin alta metoda .

             4. d) Testările serologice şi biologice menţionate la punctul 5 B(a)(b) (cj vor fi făcute pe plante crescute în sera pe probe luate din cel puţin două poziţii de pe fiecare tulpina,

                incluzând o frunză tânără întreagă din vârful fiecarei tulpini şi o frunză mai veche de la mijlocul tulpinii.

                Trebuie ridicate probe din fiecare tulpina datorită posibilei existenţe a unei infecţii nesistemice.

                În cazul testelor serologice, proba de analizat trebuie să fie formata din frunze prelevate de pe aceeaşi plantă.

                Nu se recomandă amestecarea frunzelor prelevate de la mai multe plante decât dacă proportia de amestec a fost validată printr-o metodă specială.

                În cazul testărilor biologice, proba este formata din frunze prelevate de la maxim cinci plante cu inocularea a cel puţin doua plante din fiecare specie indicator.

             5. e) Plantele indicator adecvate pentru folosire în testarea biologică menţionată la punctul 5 B(a),(c ) sunt cele listate de catre Organizaţia Europeană şi Mediteraneană pentru Protecţia Plantelor (OEPP), sau alte plante indicator aprobate oficial, despre care s-a dovedit ca detectează virusurile respective.

             6. f) Se scoate din carantină numai materialul care a fost direct testat.

             După efectuarea testarii ochiurilor, se scoate din carantină numai materialul (plantulele) rezultat din tuberculii analizaţi.

             Nu este permisă scoaterea din carantînă a tuberculului ca atare din cauza posibilelor probleme cu infecţiile nonsistemice.

             C – Potato spindle tuber viroid

             a(1) Pentru întregul material, se testeaza plante cultivate în ser'½ de îndată ce s-au acomodat bine, dar înainte de înflorire şi

             producerea polenului.

             (2) Testarea lăstarilor tuberculilor ,a plantulelor crescute in vitro sau a răsadurilor tinere este privită numai ca o testare preliminară.

             1. b. Probele se alcătuiesc dintr-o frunză complet dezvoltată din vârful fiecarei tulpini a plantei.

             2. c. Întregul material pentru testare se cultiva la temperaturi care să nu fie mai mici de 18° C (preferabil la temperaturi mai mari de 20° C) şi la o fotoperioadă de cel puţin 16 ore.

             3. d. Testarea probelor de ADN şi ARN se radioactivă sau neradioactivă, retum-PAGE Ag)sau prin RT-PCR.

                face pnn marcare (prin colorare cu

             4. e. Proportia maxima de amestecare pentru alcătuirea unei probe şi return-PAGE este de cinci plante, iar utilizarea acesteia sau a proportiilor mai mari trebuie validată.

             1

             Sectiunea 5: Metoda pentru detectarea si diagnosticarea

             bacteriei care provoaca putregaiul inelar al cartofului, Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. Sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Davis et al. in loturile de tuberculi de cartofi

             1. 1. Prelevarea conurilor.

                L 1 Se spala 200 de tuberculi in apa de la robinet si de indeparteaza epiderma dinjurul punctului de insertie al fiecarui tubercul de cartof, folosirid un bisturiu sau un cutit de curatat cartofi, desinfectat periodic c;lezinfectia de poate face prin înmuierea cutitului in solutie de ethanol 70% inainte de flambare.

                1.2. a) Se scot cu grija conu i de tesut din punctul de insertie al cartofului cu un bisturiu sau un cutit de cartofi, evitandu-se prelevarea de tesut nevascular in exces.

                b) Dupa scoatere, conurile trebuie-• , prelucrate in maxim 24 de ore

                (v. paragraful 3) sau pastrate timp de maxim doua saptamani, la o temperatura de -20°C.

             2. 2. Examinarea vizuala a simptomelor vestejirii bacteriene.

                Dupa scoaterea conurilor, se sectioneaza fiecare tubercul si sţ cauta prezenta simptomelor de putregai inelar.

                Se storc tuberculi si sa urmareste daca din tesutul vascular exudeaza tesuturi macerate.

                Simptomele timpurii se prezinta sub forma unui aspect usor sticlos sau translucid a tesutului, fara inmuiere in jurul tesutului vascular aceste simptome in specia.I in punctul de insertie al tuberculului.

                Inelul vascular poate prezenta, la punctul de insertie, o culoare usor mai închisa decat cea normala.

                –Primele simptome –usor identificabile apar sub forma unei coloratii galbui inelului vascular. Cand tuberculul este presat usor, din vase se elimina un exudat cu un aspect branzos. Acest exudat contine

                milioane de bacterii si, in aceasta faza, se poate produce o colorare bruna a tesutului vascular.

                La inceput, aceste simptome pot aparea doar pe o parte a inelului, nu neaparat in apropierea punctului de insertie, si apoi se extind treptat pe tot inelul.

                Pe masura ce infectia avanseaza, tesuturile vasculare sunt distruse si cortexul extern se poate separa de cel intern.

                In stadiile avansate ale infectei, apar crapaturi la suprafata tuberculului, avand adesea o culoare brun-rosietica pe margini.

                Simtomele pot fi mascate de invazii fungice sau bacteriane secundare si este foarte dificil, daca nu imposibil, sa se. distinga simptomele avansate ale putregaiului inelar de celelalte putregaiuri ale tuberculului.

             3. 3. Pregatirea probelor pentru coloratia Gram, colorarea pnn imunoflorescenta (IF) si testul pe vinete

                1. 3.1 Se omogeneizeaza conurile pana la macerare completa intr-un diluant cunoscut ca fiind netoxic pentru Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (de exemplu tampon fosfat salin

                   0.05 M (TFS) de 0.05 M si pH 7.0), la o temperatura mai mica de 30 de garde C. Se recomanda adaugarea unui defloculant netoxic şi a unui agent antispumant netoxic (apendice 1 şi 2). Trebuie evitata o macerare excesiva.

                2. 3.2 Se extrag bacteriile din amestecul omo_gen prin una din 1netodele urmatoare 1:

             A. a) Se centrifugheaza la nu mai mult de 180 g timp de 10 minute;

             b) Se centrifugheaza supematantul la nu mai puţin de 4 OOO g timp de 1O minute. Se lasa la decantat, iar apoi supematantul se elimina.

             

             1O metoda de extractie alternativa este data de Dinesen, 1984

             

             

             1Existadovada(JansrsiVanVarrenberg,1987)căprincongelaresepoatereduceviabilitatealuiC.m.spp.Sepedonicus.Serecomandăsuspensiadepozituluiinsolutiedeglicerol10%.

             4.3 Se identifica probele care conţin celule corineforme tipice, Gram pozitive. În general, celulele de C.m. spp.sepedonicus au o lungime de 0,8 până la 1,2 µm şi o lăţime de 0,4 până la 0,60 µm.

             În apendicele 3 se indică un procedeu de colorare adecvat.

             Preparatele din infecţii naturale sau culturi recent izolate prezintă adesea o predominanţă de bastonase cocoide, care sunt de obicei

             mai mici decât celulele din culturile mai vechi insamantate pe mediu de agar. I"n majoritatea mediilor de cultură, celulele de C.m. spp.sepedonicus se prezinta ca niste bastonase corineforme

             pleomorfe şi pot da o reacţie Gram variabilă. Celulele sunt unice? în perechi cu „coturi" caracteristice, tipice pentru divizarea corinebacteriilor şi, ocazional, în grupuri neregulate asemenea unor palisade şi litere chinezeşti.

       5. 5. Protocol pentru testarea IF

          1. 5.1 Se utilizează un antiser pentru o tulpina cunoscută de C.m. spp.sepedonicus-ATCC 33113 (NCPPB 2137) sau NCPPB 2140. Aceasta trebuie să aibă un titru IF mai mare de 1:600. Se include un control TFS pe lama de testare pentru a se determina dacă imunoglobulina anti-iepure conjugată cu izotiocianat de fluoresceina (ITCF) se combină nespecific cu celulele bacteriene.

             C.m. spp.sepedonicus (ATCC 33113 (NCPPB 2137 ), NCPPB 2140) ar trebui utilizat ca si control de antigen omolog pe o lama separata. Ţesutul infectat natural (conservat prin liofilizare sau congelare la-20 C) se utilizează, dacă este posibil, ca un control similar pe aceeaşi lamelă (figura 2).

          2. 5.2 Procedeul

             1. 5.2.1 Din depozitul-final, se prepara trei serii de dilutii (10 102, 103) in apa distilata (figura 1).

                5.2.2. Din fiecare diluţie a depozitului sau din fiecare suspensie de

                C.m. spp, sepedonicus (aproximativ 106 celule/ml), se pipeteaza un volum standard masurat, suficient pentru a acoperi godeul (aproximativ 25µ1), în godeurile unei lame cu spoturi multiple

                după cum se prezintă în figura 1.

                5.2.3. Se lasa la uscat la o temperatura de aproximativ 37 °C s1 se fixeaza cu solutie de etanol 95% sau prin flambare.

                Figura I

                

                Lamela de control cu mostra si tampon fosfat salin Mostră nediluată Mostră diluată

                1:10 1:100 1:1000

                

                

                (

                ,, _/,.:

                , "

                

                1

                –,       ,,,r

                –l

                f       ,,/ J

                )

                

                '

                I în dupHcat

                00000 ,,

                

                

                Antiser la soluţia selectată

                Figura 2

                Lama de control pozitiv

                00000

                00000

–

C. sepedonicus

C 1C)61ml

–

Extract pozitiv de cartofi

t ' t f t

1 :200 1:400 1:800 1:1800 1:3200.

Concentraţia de antiscrum

5.2.4 Se acopera godeurile respective cu antiser pentru C.m. spp. sepedonicus la dilutiile recomandate, TFS de O.O1, pH 7.2, conform figurii 1. (Se utilizeaza TFS pentru controlul ITCF). Dilutia de lucru a antiserului trebuie să fie egala cu aproximativ jumătate din titrul IF. Dacă trebuie folosite alte diluţii antiser, se pregătesc lame separate pentru fiecare diluţie ce urmează a fi utilizată.

1. 5.2.5. Se incubează într-o cameră umedă, la temperatura ambiantă, timp de 30 de minute.

2. 5.2.6. Se clăteşte cu grijă cu TFS de 0,01 M şi pH 7,2. Se spală timp de 5 minute în trei reprize cu TFS 0,01 M şi pH 7,2, schimbandu­ se de fiecare data solutia de spalare.

3. 5.2.7. Se elimină cu grijă excesul de umezeală.

5.2.8. Se acoperă fiecare godeu cu conjugat ITCF în aceeaşi diluţie utilizată pentru determinarea titrului şi se incubează-într-o cameră umedă întunţcoasă, la temperatura ambiantă, timp de 30 de minute.

1. 5.2.9. Se clăteşte şi se spală ca mai înainte.

2. 5.2.10. In fiecare godeu, se pun 5 până la 10 µl de glicerina tamponată cu fosfat 0.1 M, cu pH 7,6 (sau o valoare similară cu un pH de minimum 7,6) şi se acoperă cu o lamela (apendice 2).

5.2.11 Se examinează cu un microscop prevăzut cu o sursă de lumină epifluorescentă şi filtre adecvate pentru ITCF. Se recomanda folosirea unui obiectiv cu o putere de marire de 400x până la 1 OOOx. Se scanează fiecare godeu replicat de-a lungul a două diametre perpendiculare şi de-a lungul perimetrului acestuia.

Se observă celulele fluorescente din controalele pozitive şi se determină titrul acestora. Se observă celulele fluorescente din gqdeul de control ITCF/TFS şi, dacă acestea sunt absente, atunci se continuă cu godeurile de test. Se determină, în minimum 1O câmpuri microscopice, numărul mediu de celule fluorescente tipice morfologic per camp şi se calculează populatia de celule pe mililitru de depozit nediluat (apendice 4).

In timpul testului de imunofluorescenţă, pot aparea mai multe probleme.

Populatii de bacterii saprofite pot indica celule fluorescente atipice morfologic si pot provoca reactii incrucisate. Alte bacterii pot parea asemanatoare cu C.m ssp. sepedonicus ca talie si morfologie. Se iau in considerare daor celulele fluorescente cu talie si morfologie tipice.

Din cauza posibilităţii producerii unor reacţii încrucişate) probele cu un test de imunofluorescenţă pozitiv trebuie să fie retestate utilizând un antiser diferit.

Limita tehnică de detectie a acestei metode se situează între 103 şi 104 celule pe ml de depozit nediluat. Probele cu un număr de celule tipice fluorescente la limita detecţiei sunt de obicei libere de C.m. ssp. seped01yicu , dar pot fi supuse testului vinetei.

Testul IF este negativ pentru toate probele in care nu s-a gasit nici o celula fluorescenta cu morfologie tipica. Se considera ca aceste probe sunt „necontaminate" cu C.m. ssp. sepedonicus.

Testul vinetei nu este necesar.

Testul IF este pozitiv pentru toate probele in care s-au identificat celule florescente cu morfologie tipica.

Probele la care s-a identificat un test de imunofluorescenţă pozitiv cu ambele antiseruri sunt considerate ca „potenţial contaminate" cu C.m. ssp. sepedonicus.

Testul vinetei este necesar pentru toate probele considerate a fi potenţial contaminate.

1. 6. Testul vinetei

   Pentru detalii de cultură, vezi apendicele 5.

   6.1 Depozitul obtinut la punctul 3.3 se inoculeaza la cel puţin 25 de vinete aflate stadiu de trei frµnze (apendice 5) printr-una din metodele indicate mai jos (punctele 6.2, 6.3 sau 6.4).

   1. 6.2. Inoculare prin tăiere I

      1. 6.2.1. Se aseaza fiecare ghiveci in pozitie orizontală intr-o excavatie facuta pe o placa de polistiren expandat cu dimensiunile de 5 cm x 1O cm x 15 cm (HxlxL) (figura 3); excavatia de mai sus este adecvata pentru un ghiveci de 1O cm. Intre tulpina vinetei si placa de polistiren expandat se introduce o folie de aluminiu sterilă pentn1 fiecare mostra testata. Planta este fixată în jurul placii cu o bandă de cauciuc.

      2. 6.2.2. Cu ajutorul unui bisturiu, se execută îQtre cotiledoane şi prima frunză o tăietură longitudinală sau uşor diagonală de 0,5 până la 1 cm lungime şi cu o adâncime de aproximativ trei pătrimi din diametrul tulpinii.

      3. 6.2.3. Se t,ine deschisă tăietura cu vârful lamei bisturiului si cu ajutorul unei pe)lsule fine, înmuiata in inocul, se tamponeaza peretii taieturii.

         Toate vinetele se inoculeaza in mod asemanator.

         Figura 3

         

         6.2.4 Se închide tăietura cu vaselină sterilă, folosind o seringă de 2 ml.

   2. 6.3. Inoculare prin tăiere li

   6.3.1 Se ţine planta între două degete şi se pipeteaza o picatura (circa 5 până la 1O µl) din inocul pe tulpină, între cotiledoane şi prima frunză.

   6.3.2. Utilizând un bisturiu steril, se execută o tăietură in diagonală (într-un unghi de aproximativ 5°), cu o lungime de 1,0 cm şi o adâncime de aproximativ 2/3 din grosimea tulpinii, tăietura începând de la picătura de inocul.

   6.3.3. Se închide tăietura cu vaselină steFilă cu ajutorul unei senng1.

   1. 6.4 Inoculare prin seringa

      1. 6.4.1. Vinetele nu se udă cu o zi înaintea inoculării pentru a reduce turgescenta

      2. 6.4.2. Se inoculează tulpinile de vânătă exact deasupra cotiledoanelor folosind o seringă cu ac hipodermic (de minimum 23G). Se distribuie inoculul intre toate plantele.

   2. 6.5 Se inoculează 25 de vinete cu o cultură cunoscută de C.m. ssp. sepedonicus şi, dacă este posibil, cu un ţesut de tubercul infectat (punctul 5.1.) prin aceeaşi metodă de inoculare (punctele 6.2., 6.3. sau 6.4.).

   3. 6.6 Se inoculează 25 de vinete cu TFS steril de 0,05 M prin aceeaşi metodă de inoculare (punctele 6.2., 6.3. sau 6.4.).

   6.7. Vinetele se incubează în condiţii corespunzatoare (apendice 5) timp de 40 de zile. Se examinează regulat simptomele după opt zile. Se numără vinetele care prezintă simptome. C.m. ssp. sepedonicus cauzează ofilirea frunzelor vinetelor, care poate începe ca o înmuiere marginală sau intemervuriana. Ţesutul ofilit poate să aibă iniţial o culoare verde închis sau pestriţă dar care devine mai pală înainte de necrozare. Ofilirile intemervuriene au adesea un aspect unsuros apos. Ţesutul necrozat are adeseori o margine galbenă strălucitoare. Vinetele nu mor neapărat cu cât este mai îndelungată perioada care precede apariţia simptomelor cu atât cresc şansele de supravieţuire. Vinetele pot învinge infecţia. Vinetele tinere susceptibile sunt mult mai sensibile la populaţiile reduse de C.m. ssp. sepedonicus decât plantele mai bătrâne, de unde necesitatea de a utiliza vinete aflate în stadiu de trei frunze sau exact înaintea acestuia.

   Ofilirile pot fi provocate de asemenea de populaţii de alte bacterii sau ciuperci prezente în depozitul tesutului de tubercul. Acestea includ Envinia carotovora, ssp. carotovora şi E. Carotovora ssp. atrosepiica,–Plioma exigua var. foveata precum şi de populaţii mari de bacterii saprofite. Aceste ofiliri pot fi deosebite de cele cauzate de C.m. ssp. sepedonicus deoarece toate frunzele sau întreaga vânătă se ofilesc rapid.

   1. 6.8 Se prepară o coloraţie Gram (punctul 4) pentru toate loturile de vinete care prezintă simptome, utilizând secţiuni de ţesut de frunză ofilită şi de tulpină de vânătă şi se izolează într-un mediu nutritiv adecvat (punctul 7). Se dezinfectează frunzele şi tulpinile vinetelor prin ştergere cu o soluţie de etanol 70 %.

   2. 6.9 În anumite cazuri, în special dacă condiţiile de creştere nu sunt optime, este posibil ca C.m. ssp. sepedonicus să existe ca o infecţie latentă în vinete chiar după incubaţia de 40 de zile. Aceste infecţii pot avea ca rezultat piticirea şi pierderea vigorii vinetelor inoculate. Dacă testul IF este considerat pozitiv, se poate considera că este necesară o testare suplimentară. -Este esenţial sa se compare ratele de creştere ale tuturor plantelor supuse testului

      vinetei cu controalele inoculate cu TFS steril de 0,05 M şi să se 1nonitorizeze conditiile de mediu din sera.

      '

      Recomandările pentru testele ulterioare sunt următoarele:

      1. 6.9.1. Se taie tulpinile deasupra locului inoculării şi se îndepărtează frunzele.

      2. 6.9.2. Se macerează tulpinile în TFS de 0,05 M şi pH 7,0 ca la punctele 3.1 până la 3.2.

      3. 6.9.3. Se utilizează o jumătate de suspensie pentru a efectua o coloraţie Gram (punctul 4) şi un test IF (punctul 5).

      4. 6.9.4. Se utilizează cealaltă jumătate pentru un nou test al vinetei (punctlll 6), dacă coloraţia Gram şi/sau testele IF sunt pozitive. Se foloseşte o cultură cunoscută C. m. ssp. sepedonicus şi controale sterile_de TFS 0,05 M. Dacă nl! se observă simptome în testul ulterior, proba este considerată negativă.

2. 7. Izolarea lui Cm. ssp. sepedonicus

   Diagnosticul poate fi confinnat doar dacă C. m. ssp. sepedonicus

   este i olat şi identificat ca atare (punctul 8). Deşi C m. ssp. Sepedonicus este un organism dificil, el poate fi izolat din ţesutul

   care prezinta simptome. Totuşi el poate fi mascat prin cresterea rapidă de bacterii saprofite şi de aceea, izolarea directă din depozitul de ţesut de tubercul (punctul 3.3.) nu este recomandată. Vinetele asigură un excelent mediu selectiv de îmbogăţire pentru dezvoltarea lui C. m. ssp. sepedonicus si, de asemenea, un excelent test gazdă de confirmare.

   Se fac izolări din toţi tuberculii de cartof şi vinete care prezinta simptome (punctele 4, 6). Dacă este necesar, macerarea tulpinilor vinetelor se face ca la punctele 3. şi 6.9.

   1. 7.1 Suspensiile se insamanteaza in striuri pe unul din urmatoare_le medii (formulele sunt indicate in apendicele 6) : ·

nutritiv dextroză-agar (numai pentru subculturi), drojdie-peptona-glucoză-agar,

drojdie-dextroză-agar,

drojdie de extract de săruri minerale agar. Se incubează la 21° C timp de 20 de zile.

1. C. m. ssp. sepedonicus creşte încet, producând de obicei colonii cu un vârf ascuţit, cremos, de forma unei cupole, în termen de 1O zile.

Pentru stabilirea puritatii, suspensia se re-insamanteaza in striuri

Ratele de creştere sunt îmbunătăţite prin subculturi. Coloniile tipice sunt de un alb cremos sau ivoriu, rotunde, netede, înălţate, cu formă de cupola convexa, muc.oid fluide, cu margini întregi şi cu un diametru de 1 până la 3 mm.

g. Identificarea

Din plantele sanatoase sau bolnave de cartofi şi vinete se pot izola numeroase bacterii corineforme Gram pozitive, cu caractere coloniale similare celor produse de C. m. ssp. sepedonicus. În acest context, C. m. ssp. sepedonicus poate fi identificat prin următoarele teste:

Testul IF (punctul 5.1), testul vinetei,

testele de nutriţie şi fiziologice (apendice 7),

• – testul oxidării/fermentării (0/F),

• – testul oxidazei,

• – creşterea la 37° C,

• – producţia de urează,

• – hidroliza esculinei,

• – hidroliza amidonului,

• – toleranţa la o soluţie de clorură de sodiu 7 %,

• – testul indolului,

• – testul catalazei,

• – producţia de H2S,

• – utilizarea citratulu(

• – hidroliza gelatinei,

• – acid din: glicerol, lactoză, ramnoză şi salicina,

• – coloratia Gram.

Toate testele trebuie să includă un control cunoscut de C.m. ssp. sepedonicus. Testele nutriţionale şi fiziologice se fac utilizând inoculuri din subculturile agar. Comparaţiile morfologice se fac din culturi de dextroză agar .

Pentru testul IF, populaţiile de celule trebuie să fie ajustate la 106 celule/ml. Titrul IF trebuie să fie similar celui al culturii cunoscute de C.m. ssp. sepedonicus.

Pentru testul vinetei, populaţiile de celule trebuie să fie ajustate la 107 celule/ml. Testele vinetei se fac utilizând zece plante pentru fiecare din organismele testate, utilizand din nou cultura cunoscuta je C.m. ssp. sepedonicus şi controale de apă sterilă; în cazul culturilor pure ofilirea se obţine în 20 de zile, dar plantele care nu prezintă simptome după această perioadă trebuie să fie incubate pe o durată totală de 30 de zile, la temperaturi care să determine dezvoltarea vinetelor,dar fără să depăşească 30°C (apendicele 5).

Dacă după 30 de zile simptomele nu sunt prezente, nu se poate confirma prezenta lui C.m. ssp. sepedonicus in cultura respectiva.

Testul 0/F Oxidază Catalază

Reducţia nitraţilor Activitatea ureazei Producţia de H2S Producţia de indol Utilizarea citrat,ilor

C.m. ssp. Sepedonicus

Inert sau slab oxidativ

+

Hidroliza amidonului – sau slab Creşterea la 37 °

Creştere.'! în soluţie de NaCI 7 –

% –

Hidroliza gelatinei

Hidroliza esculinei + Acid din:

• – glicerol

• – lactoză – sau slab

  -ramnoză

• – salicina

Apendicele 1

FORMULA FLUIDULUI DE MACERARE RECOMANDAT DE LELLIOTT ŞI SELLAR, 1976

Compus D C silicon MS A (Hopkins Williams 1O ml Ltd, Cat. Nr. 9964 – 25, Chadwell Heatch,

Essex, Anglia)

Fulgi de lubrol W (ICI Ltd) 0,5 g

Pirofosfat de tetrasodiu 1 g

Tampon fosfat salin 0,05 M cu pH 7,0 1 litru (apendicele 2)

SOLUT• II TAMPON

Apendicele 2

Tampon fosfat salin 0,05 M cu pH 7,0

Această soluţie tampon poate fi folosită pentru macerarea ţesuturilor de tuberculi (2.1)

Na2HPO4 KH2PO4

NaCl

Apă distilată până la

Tampon fosfat salin de 0,01 M cu pH 7,2

Această soluţie tampon este utilizată pentru diluarea antiserurilor şi spălarea lamelelor IF

Na2HPO412 H2O –

NaH2PO42 H2O

NaCl

Apă distilată până la

Glicerină fosfatică tamponată de 0,1 M cu pH 7,6

Această soluţie tampon este utilizată pentru mărirea fluorescentei în cadrul testului IF

2

'Na HPO412 H2O

NaH2PO42 H2O

Glicerol Apă distilată

4,26 g

2,72 g

8,0 g

1 litru

2,7 g

0,4g

8,0 g

1 litru

3,2 g

0,15 g

50ml 100

ml

Apendicele 3

PROCEDEUL COLORĂRII GRAM (MODIFICAREA LUI HUCKER) (DOETSCH, 1981)

Solut•ie de cristale violete

Se dizolvă 2 g de violet cristalin în 20 ml etanol 95 %. Se dizolvă 0,8 g oxalat de amoniu în 80 ml apă distilată. Se amestecă solut,iile.

Iodul Lugol

Iod 1 g

Iodură de potasiu 2 g Apă distilată 300 ml

Cristalele solide sunt pisate într-un mojar. Se adaugă apă şi se agită până la dizolvare într-un recipient închis.

Solutia de colorare cu safranina

'

> ,

Se alcătuieste solutia:

Safranina O Etanol 95 %

2,5 g

100ml

Se amestecă şi se stocheaza.

Se diluează: 1:1O pentru a obţine o soluţie de lucru.

Procedeul de colorare

1. 1. Se pregătesc frotiurile şi dispozitivele de uscare şi încălzire cu

   aer.

2. 2. Se imersează lamela într-o soluţie de violet cristalin timp de un minut.

3. 3. Se spală cu apă de Ia robinet.

4. 4. Se imersează în iod Lugol timp de.un minut.

5. 5. Se spală cu apă de la robinet şi se uscă cu un absorbant..

6. 6. Se decolorează cu etanol 95 %, adăugat prin picurare,. până când nu se mai decoloreaza sau se imersează in etanol timp de 30 de secunde, agitand usor.

7. 7. Se spală cu apă de la robinet şi se usucă cu un absorbant.

8. 8. Se imersează în soluţie de safranina timp de 10 secunde.

9. 9. Se spală cu apă de la robinet şi se usucă cu un absorbant.

Coloraţia bacteriilor Gram pozitive este violet-albastră; bacteriile Gram negative au o coloraţie roz-roşie.

Apendicele 4

DETERMINAREA POPULAT, IEI DE CELULE POZITNE LA TESTULIF

Aria (S) godeului lamelei multispot

–

4(1)

Unde D = diametrul ferestrei. Aria(s) câmpului obiectivului

JZd2

= 4 (2)

unde d = diametrul campului.

Se calculează d prin măsurare directă sau prin formulele următoare:

unde i = coeficientul câmpului (depinde de tipul ocularului şi variază de la 8 la 24)

K = coeficientul tubului (1 sau 1,25)

G = puterea de marire (100 x ,40 x, etc) a obiectivului

{E

din (2), se obtine d –v Jr

din (3t se obtine d = J[ GK (4)

Se numără celulele fluorescente tipice pe câmp (c).

Se calculează numărul celulelor fluorescente tipice pe godeu (C).

s

C=C-

s

Se calculează numărul celulelor fluorescente tipice pe ml de depozit (N).

N= CxIOOO xF

y

unde y = volumul depozitului pe godeu, unde F = factorul de diluţie a depozitului.

Apendicele 5

CULTURA VINETELOR

Se însămânţează seminţe de vânătă (Solanum melongena cv. Black Beauty) într-un compost pasteurizat pentru seminţe. Se planteaza plantulele cu cotiledoane complet dezvoltate (10-14 zile) intr-un compost pasteurizat pentru ghivece.

Se utilizează vinete în stadiu de trei frunze, atunci când cel putin două dar nu mai mult de trei frunze sunt desfăcute complet.

Vinetele trebuie să fie cultivate în sera, în următoarele condiţii:

durata zilei: temperatura:

14 ore de lumină naturală sau mai mult; ziua: 21 până la 24° C,

noaptea: 15° C.

N.B.: C.m. ssp. sepedonicus nu creşte la temperaturi de peste 30° C. Dacă temperaturile nocturne nu scad la 15 ° C se poate produce deteriorarea cromoforului (necroza argintie).

Deteriorarea rădăcinii cauzate de larvele sciaride poate fi evitata prin aplicarea unui insecticid adecvat.

Vânăta Black Beauty poate fi obţinută de la firmele următoare:

1. 1. AB Hammenhogs Fro, 50-Hammenhog,

   S,veden;

2. 2. HURST Seeds Ltd, Avenue Road,

   Witham,

   Essex CM8 2DX, England;

3. 3. ASGRO Italia Sp A

   Corso Lodi, 23, Milan;

4. 4. KUPPER

Mitteldeutsche Samen GmbH, Hessenring 22,

D-3 7269 Eschwege.

Apendicele 6

MEDII PENTRU CREŞTEREA ŞI IZOLAREA LUI CM. SSP. SEPEDONICUS

Agar nutritiv (NA)

Agar nutritiv difco bacto în apă distilată la standardul producătorului. Se sterilizează prin autoclavare la 121 ° C timp de 15 minute.

Dextroză agar (NDA)

cu un conţinut de 1 % D (+) glucoză (monohidrat). Se sterilizează prin autoclavare la 115 ° C timp de 20 minute.

Drojdie-glucoză-peptona agar (YPGA)

Extract de drojdie difco bacto (nr. 0127)

bacto Peptonă difco bacto (nr. 0118) D (+)- glucoză (monohidrat)

Agar purificat difco bacto (nr. 0560) Apă distilată

5g 10 g

15 b°

I litru

Se sterilizează 0,5 l de mediu prin autoclavare la 115 ° C timp de 20

de minute.

Mediu de extract de drojdie de săruri minerale (YGM)

Extract de drojdie difco bacto

D (+)- glucoză (monohidrat)

2,0 g

g

….., .-

L,)

0,25 g

Se sterili ează 0,5 l mediu prin autoclavare la 115 ° C timp de 20 de minute.

Apendicele 7

TESTE NUTRIŢIONALE ŞI FIZIOLOGICE PENTRU IDENTIFICAREA LUI C M. SSP. SEPEDONICUS

Toate mediile trebuie să fie incubate la 21° C şi se examinează după 6 zile. Dacă creşterea nu a avut loc, se incubează până la maximum 20 de zile.

– Testul oxidativ şi fermentativ (Hugh şi Leipson, 1953) – testul O/F.

Mediul de bază:

KCl

MgSO4_ 7H2O NH4H2PO4

Peptonă difco bacto

Agar purificat difco bacto D(+)-glucoză (monohidrat) Albastru de bromtimol Apă distilată

0,2 g

0,2 g

1,0 g

1,0 g

3,0 g

10,0 g

0,03 g

1 litru

Se amestecă şi se ajustează la un pH de 7,0 până la 7,2 cu KOH lN.

Se distribuie cate 5 ml şi 1O ml în eprubeta de cultură Pyrex de 16 mm x 100 mm (capacitate 12 ml).

Se sterilizează prin autoclavare la 115° C timp de 1O minute

Se inoculează fiecare cultura prin intepare adanca in eprubeta ge 5 si l O ml. In mod antiseptic, se adaugă 1 până la 2 ml parafină lichidă sterilă in eprubeta de 1O ml. Se incubează.

Reacţie pozitivă:

• – Testul oxidazei (Kovacs, 1956) Reactivul h1i K9vacs pentru testul oxidazei:

  Soluţie apoasă de dihidroclorură de tetrametil parafenilenediamin

  (BDH nr. 30386) 1 % în apă distilată.

  Acest reactiv trebuie să fie preparat proaspăt în volume de 1 ml sau poate fi conservat într-o sticlă maronie la 5 ° C timp de 1 până la patru săptămâni.

  Se pune o picătură de reactiv pe o hartie de filtru într-un vas Petri curat. Se rade imediat o parte din cultura de testare de pe agarul nutritiv utilizând o ansa de platină.

  Reacţie pozitivă: Apare o coloraţie purpurie în termen de 1O secunde. Culturile pentru care coloratia apare intr-un timp de 10 până la 30 de secunde sunt slab pozitive.

  N.B.: Este esenţial să se utilizeze o ansa de platină şi culturi NA

  deoarece urmele de fier sau continutul ridicat de zahăr din mediul de creştere pot da rezultate pozit' ive false.

• – Producţia de acid din lactoză, ramnoză, salicina, glicerol.

  Se prepară un mediu Hugh şi Leifson O/F fără glucoză. Se–distribuie cate 5 ml în eprubete. Se sterilizează prin autoclavare la 115 ° C timp

  de 10 minute. In procesul de topire, cand baza atinge 45°C, se adaug in mod aseptic, 0,5 ml de soluţie apoasa 1O %, sterilizata prin filtrare, fie de glicerol, lactoză, ramnoză sau salicina. Se amestecă cu grijă.

  Reacţie pozitivă: Schimbarea culorii din verde-albastru în galben indică producerea acidului.

• – Testul catalazei

  Se pune o picătură de peroxid de hidrogen (30 de volume) pe o lama curată şi se emulsifiaza adaugand continutul unei anse de platina de cultura.

  Reactie pozitiva: Producerea de bule de oxigen indică prezenţa catalazei.

• – Reductaza nitratului şi denitrificarea (Bradbury, 1970) Mediu de cultură:

  KNO3 (fără nitrit) lg Extract de drojdie difco bacto K2HPO4 5 g

  Apă distilată

  lg

  1 litru

  Se dozează cate 1O ml în sticle de 20 ml. Se sterilizează prin autoclavare la 121° C timp de 15 minute.

  Reactiv A:

  

  8g

  Acid acetic 5N Reactiv B: Naftilamină

  1 litru

  5g

  Acid acetic 5N 1 litru

  Se inoculează mediul de nitrat în duplicat. Se testează după 1O şi 20 de zile adăugând o picătură de iod Lugol, 0,5 ml reactiv A şi 0,5 ml reactiv B. Dacă mediul nu devine roşiatic, se adaugă aproximativ 50 mg pudră de zinc. Se observă reacţia culorii.

  Reacţia pozitivă:

  Nici o reducere de nitrat

  Reducerea nitratului până la nitrit (numai reductaza nitratului)

  Reac,tia culorii Etapa 1 incolor

  roşu

  Etapa2 roşu

  Reducerea nitratului peste nitrit (denitrificare – reductaza nitratului şi nitritului)

  incolor incolor

• – Producţia de urează (Lelliott, 1966) Mediu de cultura:

Bază de uree oxoid agar (CM53) Apă distilată

2,4 g

95 ml

Se sterilizează prin autoclavare la 115° C timp de 20 de minute. Se răceşte baza topită pana la 50° C şi se adaugă, in mod antiseptic, 5 ml de soluţie de uree apoasă 40 % (oxoid SR20) sterilizată prin filtrare. Se amestecă bine.

Se dozează cate 6 ml în eprubete sterile (16 x 100 mm) şi se lasă să se-depună în pantă.

Reacţie pozitivă: Mediul galben-portocaliu capătă o coloraţie roşie

vişinie sau roz fucsină, dacă s-a produs o urează. Utilizarea citratului (Christensen) (Skennan, 1967)

Bază de citrat agar (Merck 2503) Apă distilată

23 g

1 litru

Se amestecă şi se dizolvă prin încălzire. Se dozează cate 6 ml, ca pentru mediul testului de producerii a ureazei. Se sterilizează prin autoclavare la 121° C timp de 15 de minute şi se Iasă să se depună în pantă.

Reacţie pozitivă: Utilizarea citratului este indicată printr-o reacţie de schimbare a culorii mediului din portocaliu în roşu.

– Producţia de sulfură de hidrogen (Rarnarnurthi, 1959) Mediu:

Tripton difco bacto (nr. O123) 1O g

N l 5g

Apă distilată 1 litru

Se dizolvă şi se dozează cate 6 ml în eprubete de 16 x I00 mm. Se sterilizează prin autoclavare la 115° C timp de IO de minute.

Se inoculează. La gura eprubetei, in mod aseptic, se pune o hârtie de acetat de_plumb (Merck 9511) Se fixează cu capacul. Se incubează timp de maximum douăzeci de zile.

Reacţie pozitivă: Producerea H2S din tripton este indicată prin colorarea negru maronie a hârtiei reactive.

– Producere de indol (Ramamurthti 1959)

Mediu:

Ca şi pentru testul H2S..

Se îndepărtează hârtia de acetat de plumb şi se adaugă 1 până la 2 ml de eter dietilic şi se agită uşor. Se lasă la decantat (5 min). Se adaugă 0,5 ml de reactiv Kovacs (Merck 9293) în eprubeta înclinat.

Reactie pozitiva: Prezenta indolului este indicată prin apariţia unei culori roşii în stratul galben dintre eter şi faza apoasa.

– Creştere la 37 ° C (Ramamurthi, 1959) Mediu:

Amestec nutritiv bacto difco NaCI

Apă distilată

8g 70 g

1 litru

Se amestecă, se dizolvă şi se dozează cate 6 ml în eprubete.

Se sterilizează prin autoclavare la 121° C timp de 15 de minute. Se inoculează şi se incubează la 37 °C.

Reacţie pozitivă: Se urmăreşte creşterea.

– Creşterea în clorură de sodiu 7 % (Ramamurthi, 1959) Mediu:

Amestec_nutritiv difco bacto NaCl

Apă distilată

8g 70 g

1 litru

Se amestecă, se di olvă şi se dozează cate 6 ml în eprubete.

Sterilizaţi prin autoclavare la 121 °C timp de 15 minute.

Reacţie pozitivă: Se urmăreşte creşterea.

– Hidroliza gelatinei (Lelliot, Billing Hayward, 1966)

Mediu:

Gelatină difco bacto (nr. 0143) Apă distilată

120 g

1 litru

Se amestecă, se dizolvă prin încălzire şi se dozează cate 6 ml în eprubete.

Se sterilizează prin autoclavare la 121° C timp de 15 de minute.

Reacţie pozitivă: Lichefierea gelatinei chiar dacă temperatura ramane de la 5° C timp de 30 de minute.

– Hidroliza amidonului Mediu:

Agar nutritiv bacto difco (topit)

.Amidon solubil bacto difco (nr.

0178)

1 litru

2g

Se amestecă şi se sterilizează prin autoclavare la 115° C timp de 1O

-de minute.

Se toarnă în vase. Se inoculeaza vasele in spoturi.

Dacă se constată o creştere bună (10 până la 20 de zile), se preleveaza–o parte·din produs şi se imersează în iod Lugol.

Reactie pozitiva: Hidroliza amidonului este indicată prin zone

limpezi, sub sau în jurul creşterii bacteriene; restul mediului se colorează în purpuriu.

– Hidrolaza esculinei (Sneath Collins, 1974) Mediu:

Peptonă bacto difco Esculină

Citrat feric (Merck 3862)

Citrat de sodiu Apă distilată

10 g

lg

0,05 g

I g

1 litru

Se dizolva prin amestecare şi se dozează cate 6 ml în eprubete. Se sterilizează în autoclavă la 115° C timp de IO de minute.

Mediul este limpede, cu o fluorescenţă albăstruie.

Reacţie pozitivă: Hidroliza esculinei este indicată prin apariţia unei culori maro si dispariţia fluorescenţei. Aceasta poate fi controlată utilizând o lampă cu raze ultraviolete.

PARTEAB

Pentru materialul listat în anexele 2 şi 4 ale Hotărârii Guvernului numarul 1030/2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România.

1.a) Măsurile oficiale de carantină includ inspecţia adecvată sau testarea pentru organismele dăunătoare relevante listate în Anexele 1 şi 2 ale Hotărârii Guvernului numarul 1030/2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România şi sunt luate în conformitate cu exigentele specifice menţionate în Anexa 4 a Hotărârii Guvernului numarul 1030/2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România pentru organismele dăunătoare specifice,

b) Pentru respectarea exigenţelor specifice, metodele folosite pentru măsurile de carantină sunt cele prevăzute în Anexa 4 a Hotărârii Guvernului numarul 1030/2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România, sau alte măsuri echivalente adecvate aprobate oficial.

1. 2. Materialul trebuie să fie găsit liber, în conformitate cu prevederile paragrafulu 1, de organisme dăunătoare relevante specificate în anexele 1, 2 şi 4 ale Hotărârii Guvernului numarul 1030/2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în RQmânia.

Regia Autonomă

e>r1i te>rt.il C>ficia.1

în pas cu timpul

Centrul pentru relaţii cu publicul

Şos. Panduri nr. 1, bloc P33, parter, sector 5, Bucureşti

PROMPT, COMOD, MODERN ŞI UŞOR DE UTILIZAT

Prompt, comod, modern – prin procurarea electronică a Monitorului Oficial al României atât în sistem abonament, cât şi selectiv, a anumitor numere ale Monitorului Oficial al României sau acte normative.

OPERATIVITATE

Tel.: 411.58.33

Fax: 410.77.36

E-mail: multimedia@ramo.ro Website: www.monitoruloficial.ro

,Î .ic::Şijdiţiile în care disp

r,restaţie re,gµ ţfe de 20 1/o pen redu.{ ţe,de 40% pen Cu aJJîi :'}Ilui „motor

aferent ârifil@fl Q03) se poate re perioada 2Z'clefţţi:i:J2-9.J; 1989 până la zi,

combinaţie de critefii'.ilJ;;}:;;lH; p răspuns

r; : !J ! : 0Jfufjea::tţff .

care a fost publicat,

·••••••r•i•e••t•a••t•e••a••s••t•a•r••u••l•u•i••*•.•••

, 2,

…2,4 5,4

Abonament pe anul 2003 la Monitorul Ofici

Partea I, în limba maghiară – 120 EUR.

Abonament pe anul 2003 la Monitorul Oficial

Partea a II-a – Dezbateri parlamentare – 192 E

. Abonament pe anul 2003 la Monitorul Oficial al R,

Partea a III-a – Publicaţii şi anunţuri – 60 EUR.

Abonament pe anul 2003 la Monitorul Oficial al Romaruet,·'i{{sJJ Partea a IV-a – Publicaţii ale agenţilor economici – 228 EUR. ·,.–

Abonament pe anul 2003 la Monitorul Oficial al României, , ,2

Partea a VI-a – Achiziţii publice – 192 EUR. Vol.46- ……. 3,2 7,1 7,8

Prin aceleaşi mijloace multimedia (e-mail, CD, dischete):

Vol.47-Aslg':liărişi easigurăriînRomarua…………………………………………………0,6 1,,2 111 Vol.48-Fondul funciar*……………………………………………………………………………7,2 b,31’1,8

Vol.49 – lementări privind locuinţl!* …………..……..………………………………….3,3 7,1 6,8

• • colectia electronică a Monitorului Oficial, Partea I şi Voi.SO-Alegeri patlanîentare şi preztden ale*…………………………………………….3,8 8,2 8,2 Parte I bis (numere incluse în abonament) Vol.51 – Societatea Română de Radiodifuziune şi Societatea Română

  1989-2002 (319 EUR) Vol.52- t ·şi po I p o; · :::::::::::::::-ii sŢ 212

  l;!H

• • selecţii Monitorul Oficial, Partea I, Partea a II-a, Partea a III-a, Vol.53 -!kg! tan pnvm cqrupţta şt orgaruzara....….……….:.····:i;····….1,3 2,8 2,8

  Partea a IV-a, Partea a V-a, Partea a VI-a (0,08 EUR/pag.) l: Jt jl !fu ci – . . . ..:::::Ji l,4

• • versiunea electronică a lucrării „Actele publicate în Monitorul Vol.56 -Adminiţ;traţia_pu licălocală*…………………………………………………………4,1 8) 8)

Oficial al României, Partea I – 22 dec. 1989 – Vol.57 – Proţe!:ţta cop.ifulU1 5,6 1tf 16

31 ian. 2003"– lucrare ce cuprinde titlurile actelor normative Vol.S8• Codul munru ………………………………………………………………………………3,2 6, 6,

Vol.59 – la e privind notarii publici. 6,2

publicate în perioada menţionată, cuindicarea actelor normative Vol.60 – Re_gle;n tări privjnd întrepripd ril mici şi mijlocii

ce au adus modificări şi/sau completări (15 EUR). -Societaµcomerciale-cadrumsuruµonal 4,6 10,1 9,4

Vol.61 – R<;_gle entări pţivind.întreprinderije mici şi mijlocii

– l!Jreglstr ea ş1_autnzar coll).er ţilor··.:·····::·..····:······:·…………..4,8 9,8 918

6,4

Preturile includ T.V.A.

Plata se face în iei, la cursul de schimb (B.N.R.) din ziua efectuării plăţii.

Vol.62 – Reglementăn pnvmd tntrepnnderile!11lO ş1l111Jlocu – Ftscalitatea ………6 12 l1,9

* Aceste lucrări conţin acte normative care au fost ulterior modificate şi/sau abrogate.

PREŢURILE

publicaţiilorlegislativepentruanul2003

–pesuporttradiţional–

*)Cuexcepţianumerelorbisîncaresepublicăactecuunvolumextinsşicareintereseazădoarunnumărrestrânsdeutilizatori.

PublicaţiileRegieiAutonome„MonitorulOficial”menţionatelapunctele1-7suntpurtătoaredeT.V.A.încotăde19%,iarcelemenţionatelapunctele8-12suntscutitedeT.V.A.

Pentrusiguranţaclienţilor,abonamentelelapublicaţiileRegieiAutonome„MonitorulOficial”sepotefectuaprinurmătoriidifuzori:

• ◆ COMPANIANAŢIONALĂ„POŞTAROMÂNĂ”–S.A.–prinoficiilesalepoştale

• ◆ RODIPET–S.A.–printoatefilialele

• ◆ INTERPRESSSPORT–S.R.L.–Bucureşti,str.HristoBotevnr.6

  (telefon/fax:313.85.07;313.85.08;313.85.09)

• ◆ PRESSEXPRES–S.R.L.–Otopeni,str.FlorideCâmpnr.9(telefon/fax:772.66.87;0745.133.712)

• ◆ M.T.PRESSIMPEX–S.R.L.–Bucureşti,bd.Basarabianr.256(telefon/fax:255.48.15;255.48.16)

• ◆ INFOEUROTRADING–S.A.–Bucureşti,SplaiulIndependenţeinr.202A(telefon/fax:212.73.54)

• ◆ ZIRKONMEDIA–S.R.L.–Bucureşti,bd.NicolaeGrigorescunr.29A,bl.N22,ap.38(telefon/fax:340.31.09)

• ◆ ACTALEGIS–S.R.L.–Bucureşti,str.BanulUdreanr.10,(telefon/fax:411.91.79)

• ◆ CURIERPRESS–S.R.L.–Braşov,str.TraianGrozăvescunr.7(telefon/fax:0268/47.05.96)

• ◆ ELIDA–S.R.L.–Braşov,str.BisericiiRomânenr.92(telefon/fax:0268/47.74.64)

• ◆ MIMPEX–S.R.L.–Hunedoara,str.IonCreangănr.2,bl.2,ap.1(telefon/fax:0254/71.92.43)

• ◆ CALLIOPE–S.R.L.–Ploieşti,str.CandianoPopescunr.36(telefon/fax:0244/51.40.52,0244/51.48.01)

	Redacția Lex24 Drept la Sursa!
	Articole Urmărește